李芬，劉晨，田雪嬌，張麗萍，4

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司；3.新世紀(jì)中學(xué)；4.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心）

多種誘變法提高植物乳桿菌產(chǎn)苯乳酸能力的研究

李芬1，劉晨2，田雪嬌3，張麗萍1，4

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司；3.新世紀(jì)中學(xué)；4.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心）

以自主分離的植物乳桿菌LY-78為出發(fā)菌株，采用單一誘變（紫外線輻照法、亞硝基胍法）和復(fù)合誘變（硫酸二乙酯-紫外、亞硝基胍-紫外）等方法進(jìn)行誘變育種。經(jīng)抑菌圈篩選、苯乳酸含量測(cè)定及遺傳穩(wěn)定性鑒定，最終由亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變獲得一株高產(chǎn)苯乳酸的優(yōu)良突變株，其苯乳酸產(chǎn)量高達(dá)712 mg·L-1，比出發(fā)菌株246 mg·L-1提高了2.89倍，為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)苯乳酸提供了優(yōu)良的菌種。

植物乳桿菌；誘變；苯乳酸

苯乳酸（Phenyllactic Acid，PLA），別名β-苯乳酸或3-苯基乳酸，即一種新型的、可由多種微生物（尤其是乳酸菌）產(chǎn)生的天然抑菌小分子物質(zhì)[1-2]。與乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素（如乳鏈球菌素）相比，PLA穩(wěn)定性、溶解性均較優(yōu)，安全無(wú)毒，耐受pH范圍廣，不僅能夠抑制多種食源性致病菌，而且對(duì)引起食品腐敗的真菌具有很好的作用，因此PLA在食品行業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景[3-5]。

根據(jù)對(duì)近五年產(chǎn)PLA的乳酸菌進(jìn)行總結(jié)，表明乳酸菌產(chǎn)PLA的產(chǎn)量普遍較低（見(jiàn)表1）。在冗雜的誘變工作中，許多學(xué)者專家都在研究可實(shí)現(xiàn)高量生產(chǎn)的誘變方法[15-16]。為提高菌株產(chǎn)PLA的能力，歷年來(lái)許多學(xué)者專家也進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)。Kamata[17]通過(guò)誘變選育了一株乳糖發(fā)酵短桿菌，結(jié)果乳糖發(fā)酵短桿菌經(jīng)發(fā)酵后 PLA產(chǎn)量達(dá)到了 1 940 mg·L-1；Hashimoto等[18]通過(guò)誘變方法誘變了1株從土壤中得到的假單胞菌（Pseudomonas sp.B C-18），能將苯乙醛-氰醇轉(zhuǎn)化成為PLA，PLA的產(chǎn)量提高到出發(fā)菌株的12倍；柴虹宇等[15]通過(guò)紫外線誘變了1株從傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品中分離的 Lactobacillus plantarum P421，PLA產(chǎn)量由原始的81 mg·L-1提高到了528 mg·L-1；王丹等[19-20]通過(guò)紫外誘變和亞硝基胍法誘變了1株從酸奶渣中分離的副干酪乳桿菌 Lactobacillus paracasei W2，PLA產(chǎn)量由原來(lái)的572 mg·L-1提高到了810 mg·L-1。眾多研究證明產(chǎn)PLA的菌株經(jīng)過(guò)誘變后PLA的產(chǎn)量都有較大的提高。

因此，從傳統(tǒng)發(fā)酵食品酸菜中篩選得到一株可高產(chǎn)PLA的菌株，其PLA產(chǎn)量為246 mg·L-1，經(jīng)分析鑒定判定其為植物乳桿菌，并將其命名為L(zhǎng)actobacillus plantarum LY-78（GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登陸號(hào)JN222930）[11]。與此同時(shí)，對(duì)Lactobacillus plantarum LY-78菌株采用單一誘變法（紫外線輻照法、亞硝基胍法）和復(fù)合誘變法（硫酸二乙酯-紫外、亞硝基胍-紫外）以期提高其PLA的產(chǎn)量，為高效率生產(chǎn)天然安全的防腐劑提供優(yōu)良菌種。

表1 近五年生產(chǎn)PLA的乳酸菌Table 1 Lactic acid bacteria producing PLA last five years

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 出發(fā)菌株和指示菌

出發(fā)菌株：Lactobacillus plantarum LY-78（Gen－Bank數(shù)據(jù)庫(kù)登陸號(hào)JN222930）；

抑菌試驗(yàn)的指示菌：金黃色葡萄球菌（Staphylocococus aureus，ATCC25923），大腸桿菌（Escherichia coli ATCC2592）。

1.1.2 主要試劑

苯乳酸（PLA）標(biāo)品，生化純，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或生化純。

1.1.3 主要設(shè)備

全溫振蕩器（HZQ-QX，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）；生化培養(yǎng)箱（SPH-250型，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；生物顯微鏡（XSZ-4G，重慶光學(xué)儀器廠）；高性能無(wú)菌實(shí)驗(yàn)臺(tái)（FLC-3型，哈爾濱市東聯(lián)儀器公司）；臺(tái)式低速離心機(jī)（TD5A-WS型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；高效液相色譜（Agilent 1100，Agilent科技公司）；紫外誘變燈（BCN-1360型，北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司）。

1.2 誘變育種方法

出發(fā)菌株生長(zhǎng)曲線的繪制：菌種活化后轉(zhuǎn)接至MRS液體培養(yǎng)基中，各組分別取5個(gè)平行樣，于37℃恒溫靜置培養(yǎng)，且每間隔2 h測(cè)定并記錄菌液的吸光度值。最后據(jù)吸光度值繪制的生長(zhǎng)曲線來(lái)確定出發(fā)菌株生長(zhǎng)最旺盛的菌齡。

1.2.1 單細(xì)胞菌懸液的制備

將菌株于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫靜置培養(yǎng)16 h至其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，4 000 r·min-1，15 min離心收集菌體，經(jīng)生理鹽水洗滌2次后，于生理鹽水中充分懸浮菌體，制成 107～108cfu·mL-1的單細(xì)胞懸浮液，備用。

1.2.2 紫外線（UV）輻照法誘變

將紫外燈（20 W，30 cm）開(kāi)啟預(yù)熱30 min，然后取10 mL制備好的單細(xì)胞菌懸液放置于直徑為9 cm的內(nèi)加磁力轉(zhuǎn)子的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，在磁力攪拌下打開(kāi)皿蓋，照射時(shí)間分別為30、60、90、120、150、180 s，取1 mL誘變后的菌懸液，稀釋后置冰水浴中2～3 h（低溫有助于抑制菌體自身修復(fù)，增加正突變幾率）37℃恒溫靜置培養(yǎng)2 h后，取0.1 mL的菌懸液涂平板（n=5），于37℃恒溫避光靜置培養(yǎng)24 h[21]，用未誘變的菌株作對(duì)照，觀察不同照射時(shí)間平板的菌落數(shù)，計(jì)算誘變后的菌株致死率。如此重復(fù)操作誘變3次后進(jìn)行分離篩選。

1.2.3 亞硝基胍（NTG）法誘變

取單細(xì)胞菌懸液分裝于三角瓶中，每瓶9 mL （n=5），并用未誘變?cè)鹤鳛閷?duì)照。將不同濃度的NTG母液[22]（比例配比NTG：丙酮為10∶1）各取1 mL置三角瓶中，搖床振蕩37℃培養(yǎng)36 min后，分別加入生理鹽水終止反應(yīng)；誘變處理后的菌液冰浴2～3 h后，于4 000 r·min-1室溫離心15 min。取菌體沉淀，用pH 6.0磷酸緩沖液離心洗滌2次后，用生理鹽水十倍梯度稀釋菌體沉淀至10-6，分別取0.1 mL涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫避光靜置培養(yǎng)24 h[23]。觀察各梯度培養(yǎng)皿菌落數(shù)，計(jì)算NTG誘變的致死率[24]。如此重復(fù)操作誘變3次后進(jìn)行分離篩選。

1.2.4 硫酸二乙酯-紫外復(fù)合誘變

硫酸二乙酯-紫外復(fù)合誘變是先對(duì)出發(fā)菌株Lactobacillus plantarum NY-34進(jìn)行硫酸二乙酯誘變，然后將經(jīng)硫酸二乙酯誘變處理的菌懸液轉(zhuǎn)入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，厚度約2 mm左右，再參照1.2.2紫外線（UV）輻照法進(jìn)行誘變。試驗(yàn)經(jīng)反復(fù)3次誘變后進(jìn)行分離篩選。

硫酸二乙酯（DES）誘變方法：分別取10 mL制備好的單細(xì)胞菌懸液裝入7個(gè)離心管中，每管加入不同體積分?jǐn)?shù)的DES溶液，于搖床37℃培養(yǎng)一定時(shí)間后，加入硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)；設(shè)計(jì)不同體積分?jǐn)?shù)的DES溶液的和誘變時(shí)間來(lái)控制致死率，采用《工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)》推薦的DES誘變條件的范圍設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)[25]。

1.2.5 亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變

亞硝基胍-紫外復(fù)合誘變是參照1.2.3亞硝基胍（NTG） 法先對(duì)出發(fā)菌株 Lactobacillus plantarum NY-34進(jìn)行誘變，然后將經(jīng)NTG誘變處理的菌懸液轉(zhuǎn)入無(wú)菌培養(yǎng)皿，厚度約2 mm左右，再參照1.2.2紫外線（UV）輻照法進(jìn)行誘變。試驗(yàn)經(jīng)反復(fù)3次誘變后進(jìn)行分離篩選。

1.3 致死率的測(cè)定

誘變劑具有致死和誘變的雙重效應(yīng)，資料報(bào)道[26]通常為確保誘變效果及程度達(dá)最佳，其致死率范圍一般位于75%～80%。因此誘變劑的最佳劑量，需由未誘變菌液為對(duì)照，以誘變菌液菌落的數(shù)據(jù)繪制曲線圖，按照如下公式算得致死率來(lái)確定。

1.4 誘變菌種篩選

1.4.1 初篩

采用雙層平板拮抗法進(jìn)行初篩[27]：先將MRS固體培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用突變菌在下層培養(yǎng)基上劃線，長(zhǎng)度約2 cm左右，37℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h，在上層倒入LB半固體培養(yǎng)基約10 mL左右，于上層培養(yǎng)基取0.1 mL指示菌涂布，37℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，通過(guò)觀察抑菌圈直徑大小，初步篩選出PLA抑菌能力強(qiáng)的突變株。

1.4.2 復(fù)篩

采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散抑菌試驗(yàn)進(jìn)行復(fù)篩[28]：先將融化的瓊脂固體培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，待其凝固后，均勻插入牛津杯；在冷卻至40～50℃的LB半固體培養(yǎng)基中接入120 μL指示菌液，搖勻后倒入上層平皿，待其凝固后，拔出牛津杯，于小孔中加入60 μL突變菌株發(fā)酵液，37℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果，采用游標(biāo)卡尺十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，由抑菌圈直徑大小判斷突變株發(fā)酵液中PLA抑菌能力強(qiáng)的突變株。

1.5 苯乳酸含量的測(cè)定

1.5.1 發(fā)酵液的預(yù)處理

參考張莉力等的方法[29]：取10 mL對(duì)指示菌仍有顯著抑制效果的菌株發(fā)酵液，加入20 mL乙醇，于5 000 r·min-1離心15 min，分別取上清液，95℃水浴40 min，用10 mL乙醚常溫萃取2次，合并2次萃取液，50℃揮干，并用甲醇溶解定容至10 mL，于冰箱中冷藏備用。

1.5.2 反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測(cè)定苯乳酸含量

參考沐萬(wàn)孟等的方法[30]：對(duì)其進(jìn)行適宜改進(jìn)，流動(dòng)相A為0.5 g·L-1三氟乙酸水溶液，B為乙腈溶液；洗脫程序?yàn)樵?～20 min時(shí)，B為10%～100%；在20～23 min時(shí)，保持B為100%；檢測(cè)波長(zhǎng)在 210 nm；柱溫是30℃；流速為1 mL·min-1；進(jìn)樣量為10 μL。

1.6 突變菌株遺傳性鑒定

將高產(chǎn)PLA突變株進(jìn)行多次連續(xù)傳代培養(yǎng)，且每代進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)及發(fā)酵液中PLA含量的測(cè)定，依據(jù)菌株培養(yǎng)特性、菌落個(gè)體形態(tài)及測(cè)定的PLA含量，來(lái)鑒定突變株的遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Lactobacillus plantarum LY-78單一誘變的結(jié)果分析

采用Lactobacillus plantarum LY-78為出發(fā)菌株，根據(jù)菌株生長(zhǎng)曲線，確定于12～16 h菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，見(jiàn)圖1。由于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的微生物是用作代謝、生理研究的良好材料，也是作菌種的最佳材料[31-32]，因此選取此時(shí)期分別對(duì)菌株進(jìn)行UV誘變和NTG誘變。

圖1 Lactobacillus plantarum LY-78生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of Lactobacillus plantarum LY-78

根據(jù)致死率確定了 Lactobacillus plantarum LY-78最佳的誘變條件，UV輻照最佳誘變時(shí)間為90 s；NTG最佳誘變時(shí)間為40 min，最佳誘變劑量為1.0 mg·mL-1。

經(jīng)單一誘變后，突變株以抑菌效價(jià)為檢測(cè)指標(biāo)，采用雙層平板拮抗法和牛津杯瓊脂擴(kuò)散法篩選；對(duì)篩選的突變株進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵液經(jīng)RP-HPLC檢測(cè)PLA含量，根據(jù)PLA含量，確定了最佳突變株分別為UV突變株 Lactobacillus plantarum UY-26和NTG突變株Lactobacillus plantarum NY-34；其PLA含量分別為591 mg·L-1和648 mg·L-1，其中突變株Lactobacillus plantarum NY-34的PLA含量見(jiàn)圖2。同時(shí)，對(duì)兩株最優(yōu)誘變菌株進(jìn)行了遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，通過(guò)對(duì)菌落形態(tài)的觀察以及PLA產(chǎn)量變化幅度的研究，結(jié)果表明，兩株菌經(jīng)過(guò)單一誘變后，不僅提高了PLA的產(chǎn)量，而且具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

圖2 菌株NY-34發(fā)酵液的RP-HPLC圖譜Fig.2 RP-HPLC chromatogram of NY-34 strains fermented liquid

2.2 Lactobacillus plantarum LY-78復(fù)合誘變的結(jié)果分析

依據(jù)Lactobacillus plantarum LY-78菌株單一誘變結(jié)果分析，經(jīng)NTG誘變獲得突變株Lactobacillus plantarum NY-34的PLA產(chǎn)量更高，表明單一誘變中NTG優(yōu)于 UV。因此，采用突變株 Lactobacillus plantarum NY-34為出發(fā)菌株，根據(jù)菌株生長(zhǎng)曲線（見(jiàn)圖3），選取12～16 h對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)其分別進(jìn)行DES-UV和NTG-UV復(fù)合誘變。

圖3 Lactobacillus plantarum NY-34生長(zhǎng)曲線Fig.3 The growth curve of Lactobacillus plantarum NY-34

根據(jù)致死率確定了Lactobacillus plantarum NY-34最佳的誘變條件。DES-UV復(fù)合誘變法最佳誘變條件：UV輻照時(shí)間100 s，DES體積分?jǐn)?shù)0.9 mg·mL-1誘變時(shí)間20 min；NTG-UV復(fù)合誘變法最佳誘變條件：UV輻照時(shí)間90 s，NTG劑量3 mg·mL-1誘變時(shí)間40 min。通過(guò)對(duì)誘變菌株的篩選、發(fā)酵以及RP-HPLC檢測(cè)PLA含量，最終確定了兩株最優(yōu)突變株，分別為DES-UV復(fù)合誘變法突變株Lactobacillus plantarum UD-27和NTG-UV復(fù)合誘變法突變株Lactobacillus plantarum UN-30，其PLA產(chǎn)量分別為683 mg·L-1和712 mg·L-1，其中突變株Lactobacillus plantarum UN-30的PLA含量見(jiàn)圖4。通過(guò)對(duì)兩株菌的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析總結(jié)得出：兩株菌經(jīng)過(guò)復(fù)合誘變后，不僅使PLA的產(chǎn)量得以提高，而且具有良好的遺傳穩(wěn)定性，為后續(xù)作為生產(chǎn)PLA菌株奠定了基礎(chǔ)。

圖4 菌株UN-30發(fā)酵液中的RP-HPLC圖譜Fig.4 RP-HPLC chromatogram of UN-30 strains fermented liquid

3 討論

綜上所述，Lactobacillus plantarum LY-78菌株經(jīng)過(guò)UV輻照和NTG單一誘變以及DES-UV和NTG-UV復(fù)合誘變后，最終得出復(fù)合誘變優(yōu)于單一誘變；其中NTG-UV復(fù)合誘變?yōu)樽顑?yōu)，當(dāng)菌株經(jīng)UV輻照90 s，NTG劑量3 mg·mL-1誘變40 min后，得到PLA產(chǎn)量最高且遺傳穩(wěn)定的突變菌株Lactobacillus plantarum UN-30；其PLA產(chǎn)量為712 mg·L-1，是原始出發(fā)菌株Lactobacillus plantarum LY-78的PLA產(chǎn)量的2.89倍，這充分證明出發(fā)菌株經(jīng)過(guò)誘變后PLA產(chǎn)量得到很大的提高，為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)PLA提供了優(yōu)良的菌種。

目前，通過(guò)文獻(xiàn)[33]對(duì)乳酸菌PLA的合成代謝調(diào)控機(jī)制的研究總結(jié)分析發(fā)現(xiàn)，影響菌株生產(chǎn)PLA的關(guān)鍵因素包括苯丙酮酸和α-酮戊二酸的濃度、乳酸脫氫酶以及氨基轉(zhuǎn)移酶。因此，為了深入探討和研究影響Lactobacillus plantarum LY-78菌株高產(chǎn) PLA的原因，正在通過(guò)分子生物學(xué)來(lái)進(jìn)一步分析Lactobacillus plantarum LY-78菌株，以期通過(guò)此方法為進(jìn)一步提高Lactobacillus plantarum LY-78菌株產(chǎn)PLA的能力而提供理論依據(jù)。

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Study of Breeding of High-yielding Phenyllactic Acid Lactobacillus Plantarum Strains by Various Mutagenesis

Li Fen1，Liu Chen2，Tian Xuejiao3，Zhang Liping1，4
（1.College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Heilongjiang Feihe Dairy Co.，Ltd；3.New Century Middle School；4.National Coarse Cereals Engineering Research Center）

Independent separable Lactobacillus plantarum LY-78 was used as the original strain，through single mutation（UV，NTG）and complex mutation（DES-UV，NTG-UV）breeding，using zone of inhibition method，concentration of phenyllactic acid and hereditary stability to screen mutant strains.After mutation，NTG-UV concentration was the highest，phenyllactic acid production reached 712 mg·L-1than the original strain yield of 246 mg·L-1increased 2.89 times，and provided excellent strains for industrialized production of PLA.

Lactobacillus plantarum；mutation；phenyllactic acid

TS201.3

A

1002-2090（2016）05-0068-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.05.013

2016-01-21

雜糧麩皮油、方便食品、燕麥蛋白與膳食纖維生產(chǎn)技術(shù)研究與示范（201303069-06）。

李芬（1991-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院2014級(jí)碩士研究生。

張麗萍，女，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：zlp57@yahoo.com.cn。