郭滿，張浩，李偉漢，陳進(jìn)宏

（1.鄭州大學(xué)附屬南陽醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，河南南陽473003；2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院普外科，上海200040）

膽固醇結(jié)石癥患者與正常人膽汁骨橋蛋白抑成核活性的比較*

郭滿1，張浩1，李偉漢1，陳進(jìn)宏2

（1.鄭州大學(xué)附屬南陽醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，河南南陽473003；2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院普外科，上海200040）

目的比較膽固醇結(jié)石癥患者與正常人膽汁骨橋蛋白（OPN）抑成核活性及濃度的差異。方法利用超速離心法結(jié)合凝膠電泳從膽固醇結(jié)石癥患者及正常人膽汁中分離、純化OPN蛋白。通過HOLAN法測定兩組OPN的成核時間及成核活性。通過ELISA法檢測膽固醇結(jié)石癥患者與正常人膽汁中OPN濃度差異。結(jié)果膽固醇結(jié)石癥患者膽汁OPN蛋白較正常人具有較短的成核時間[（17.7±1.07）d vs（20.4±1.90）d]，較弱地抑制膽固醇結(jié)晶成核活性；且膽固醇結(jié)石癥患者膽汁OPN蛋白濃度低于正常人膽汁OPN蛋白濃度[（69.60±5.41）ng/m l vs（82.08±5.63）ng/m l]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論與正常人比較，膽固醇結(jié)石癥患者膽汁OPN蛋白抑制膽固醇成核活性較弱、濃度較低。

膽固醇結(jié)石；骨橋蛋白；抑成核活性

膽石癥是消化系統(tǒng)常見疾病，隨著近年來人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)等的改變，目前膽石癥發(fā)病率呈現(xiàn)出逐漸增高的趨勢，其中以膽固醇結(jié)石增長最為迅速。膽固醇結(jié)石形成的首要條件是膽固醇從膽汁中析出結(jié)晶，再此過程中許多對膽固醇成核具有抑制或促進(jìn)作用的因子發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）是一種磷酸化糖蛋白，約含314個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量約為44 kD，廣泛地分布于多種組織和細(xì)胞中，與多種人類疾病相關(guān)[1-2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，膽汁中OPN作為重要的抑成核因子，具有延長膽固醇結(jié)晶、成核的作用[3]。本研究旨在進(jìn)一步研究膽固醇結(jié)石癥患者與正常人膽汁OPN蛋白濃度及對膽固醇成核活性影響的差異，以求更進(jìn)一步探索OPN在膽固醇結(jié)石形成過程中所發(fā)揮的作用及機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

膽固醇結(jié)石癥患者的膽汁22份（標(biāo)本取自鄭州大學(xué)附屬醫(yī)院南陽醫(yī)院2014年2月～2014年7月入院接受治療的膽固醇結(jié)石癥患者，結(jié)石分類參照傅培彬法[4]），正常人的膽汁10份（標(biāo)本取自該院同期入院接受治療的腹部外傷和肝移植手術(shù)患者），本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并獲得患者知情同意。膽汁標(biāo)本按照STRASBERG[5]所述的方法分裝于無菌管中，4℃、10 000 r/min離心15min，去除雜質(zhì)，然后加入膽汁保存液（0.05%氯霉素、3mmol/L疊氮鈉、1mmol/L亮抑酶肽和5mmol/L依地酸鈉）置于-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膽汁泡的制備取膽固醇結(jié)石癥患者和正常人膽汁各5 ml，25 000 r/min離心10min（5415D，Eppendorf，德國）。抽取上層清液，并以0.22μm濾膜過濾雜質(zhì)，濾得清液后加入甲泛葡胺（Sigama）形成密度梯度，然后以45 000 r/min超速離心3 h，針吸法收集上層半透明液即為膽汁泡。

1.2.2 膽汁OPN蛋白的分離和鑒定取100μl膽汁泡，加丙酮200μl充分混勻，2 500 r/min離心15min，針吸法抽棄上清液，留取沉淀物溶解于樣品緩沖液中。微量加樣器將兩組樣品分別加于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）梳齒中，50mA恒定電流下電泳。電泳完畢后，凝膠以1%考馬斯亮藍(lán)R250染色6 h，之后脫色。切取44 kD相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白及其所對應(yīng)電泳條帶，取其中1份轉(zhuǎn)膜采用鼠抗人OPN抗體（Abcam）用Western blot法鑒定提取蛋白性質(zhì)。另外部分置入透析袋50mA恒定電流3 h，濃縮，脫鹽，凍干備用。

1.3 膽固醇結(jié)石癥患者與正常人膽汁OPN蛋白抑成核活性比較

參照改良的KIBE法[6]，控制總脂肪濃度（膽鹽+卵磷脂+膽固醇）為100 g/L，膽固醇飽和指數(shù)為1.2，膽鹽/磷脂為4。具體成分：膽鹽129.54 mmol/L，卵磷脂32.38mmol/L，膽固醇13.56mmol/L。取膽固醇結(jié)石癥患者、正常人OPN蛋白及人標(biāo)準(zhǔn)白蛋白，分別加入模擬膽汁中，控制蛋白濃度50μg/ml，每組重復(fù)8份，置于37℃恒溫保存。連續(xù)30 d每日同一時間，在偏光顯微鏡下觀察膽固醇結(jié)晶析出情況。參照HOLAN法[7]計算成核時間，即從試驗(yàn)開始到出現(xiàn)鏡下可見結(jié)晶的時間；一般認(rèn)為白蛋白無明顯成核活性，以膽固醇結(jié)石癥患者與正常人膽汁OPN蛋白組成核時間/白蛋白組成核時間計算成核活性。

1.4 膽固醇結(jié)石癥患者與正常人膽汁OPN蛋白濃度比較

建立OPN蛋白ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用倍比稀釋法設(shè)將包被液純化的OPN蛋白抗體依次加到酶標(biāo)板中，每孔100μl，37℃包被2 h，然后用2%牛血清白蛋白37℃封閉2 h后拍凈。將系列稀釋度OPN蛋白標(biāo)準(zhǔn)品依次加入酶標(biāo)板孔，每孔100μl，45℃反應(yīng)1 h后拍凈。接著每孔加入HRP 100μl（1∶40稀釋），37℃反應(yīng)1 h后每孔加入新鮮酶標(biāo)底物液100μl，37℃下置暗處15min，加終止液，取450 nm波長濾光片，于酶標(biāo)儀上讀取每孔OD值，建立OPN蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，推導(dǎo)曲線方程。然后以ELISA法檢測膽固醇結(jié)石癥患者及正常人膽汁中OPN蛋白濃度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，成核實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用方差分析，方差分析有意義的基礎(chǔ)上，再用LSD檢驗(yàn)法進(jìn)行兩兩比較；膽汁OPN濃度數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膽汁OPN蛋白的分離、純化結(jié)果

SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，膽固醇結(jié)石癥患者和正常人膽汁中OPN蛋白的分離、純化效果良好。見圖1。

2.2 膽汁OPN蛋白的鑒定結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)中從44 kD相對分子質(zhì)量所對應(yīng)電泳條帶中提取的蛋白為骨橋蛋白。見圖2。

圖1 膽固醇結(jié)石癥患者和正常人膽汁OPN蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果

圖2 膽固醇結(jié)石癥患者和正常人膽汁中骨橋蛋白鑒定結(jié)果

2.3 膽固醇結(jié)石癥患者和正常人膽汁OPN蛋白成核活性比較

根據(jù)HOLAN法計算人標(biāo)準(zhǔn)白蛋白、膽固醇結(jié)石癥患者和正常人膽汁OPN蛋白成核時間分別為（15.0±1.64）d、（17.7±1.07）d和（20.4±1.90）d，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=21.431，P=0.007）。膽固醇結(jié)石癥患者和正常人膽汁OPN蛋白成核時間與人標(biāo)準(zhǔn)白蛋白組比較，經(jīng)LSD檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P= 0.023和0.009）；膽固醇結(jié)石癥患者膽汁OPN蛋白成核時間和正常人膽汁OPN蛋白成核時間比較，經(jīng)LSD檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.014）。以膽固醇結(jié)石癥患者與正常人膽汁OPN蛋白組成核時間/白蛋白組成核時間計算成核活性，膽固醇結(jié)石癥患者膽汁OPN蛋白成核活性中位數(shù)為1.18，低于與正常人1.36。見表1。

2.4 膽固醇結(jié)石癥患者和正常人膽汁OPN蛋白濃度比較

由ELISA法得到標(biāo)準(zhǔn)蛋白系列稀釋吸光度，建立曲線方程為：Y=0.037X（Y：吸光度；X：OPN蛋白濃度mg/ml，相關(guān)系數(shù)r=0.99）。由ELISA法測得膽固醇結(jié)石癥患者和正常人膽汁OPN蛋白含量分別為（69.60±5.41）ng/ml和（82.08±5.63）ng/ml，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表1 膽固醇結(jié)石癥患者和正常人膽汁OPN蛋白成核時間和成核活性

表2 膽固醇結(jié)石癥患者和正常人膽汁OPN蛋白含量測定

3 討論

OPN作為一種分泌型磷酸化糖蛋白，在人體多種病理生理過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。早期研究即已發(fā)現(xiàn)，OPN在肝臟、膽囊及膽汁中有豐富表達(dá)[8]。然而直到近年來OPN參與膽石癥形成的一些機(jī)制才逐漸為人們所知[9-10]。NAKAI等[11]研究發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)結(jié)石患者肝內(nèi)膽管、腺體及結(jié)石中都有OPN的表達(dá)。ICHIKAWA等[12]也發(fā)現(xiàn)，膽固醇結(jié)石癥患者膽囊壁富含OPN蛋白及高表達(dá)OPN的巨噬細(xì)胞浸潤，且膽固醇結(jié)石核心存在高表達(dá)OPN的巢式膜狀結(jié)構(gòu)成分。本課題組前期研究觀察到OPN能抑制模擬膽汁和人膽汁膽固醇結(jié)晶生長，穩(wěn)定膽固醇/磷脂泡，抑制膽固醇析出[13]。動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，隨著膽固醇攝入的增加，豚鼠肝臟和膽囊OPN的表達(dá)逐漸增加，6周后降至基線水平，通過對該動態(tài)過程的分析，本研究認(rèn)為膽囊和肝臟通過影響和調(diào)節(jié)OPN分泌，進(jìn)而影響膽固醇結(jié)石的形成[14]。人體實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，膽囊膽固醇結(jié)石癥患者膽囊高表達(dá)OPN及其受體整合素的纖維化、萎縮的上皮細(xì)胞，且膽固醇結(jié)石癥血清及膽汁OPN濃度較正常人低[15]。因此，本研究認(rèn)為，OPN在膽囊膽固醇結(jié)石形成過程中發(fā)揮抑制成核的作用。本實(shí)驗(yàn)通過ELISA法進(jìn)一步證實(shí)，膽固醇結(jié)石癥患者膽汁OPN蛋白含量低于正常人（P<0.05）；同時發(fā)現(xiàn)，膽固醇結(jié)石癥患者膽汁OPN蛋白具有較弱的抑成核作用，其成核時間，抑制膽固醇結(jié)晶形成的作用低于正常人膽汁OPN蛋白，兩組平均成核時間分別為（17.7±1.07）d vs（20.4±1.90）d，成核活性為（1.18 vs1.36），差異有統(tǒng)計學(xué)意義，該結(jié)果提示，膽固醇結(jié)石癥患者膽汁OPN蛋白可能與正常人膽汁OPN蛋白存在結(jié)構(gòu)上的差異，由此導(dǎo)致膽固醇結(jié)石癥患者膽汁中OPN蛋白抑制膽固醇成核活性較正常人膽汁中OPN蛋白差。

綜上所述，膽固醇結(jié)石癥患者膽汁中OPN濃度的減少及結(jié)構(gòu)功能的差異共同參與膽固醇結(jié)石的形成和發(fā)展，后續(xù)實(shí)驗(yàn)有待于進(jìn)一步研究膽固醇結(jié)石癥患者與正常人膽汁OPN蛋白結(jié)構(gòu)的差異及其結(jié)構(gòu)差異影響OPN蛋白抑制成核活性的具體機(jī)制。

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（張西倩編輯）

Com parison of anti-nucleation activity of biliary osteopontin from cholesterol gallstone patients and normal individuals*

Man Guo1,Hao Zhang1,Wei-han Li1,Jin-hong Chen2
(1.Department of Galactophore and Thyroid Surgery,Nanyang Hospital of Zhengzhou University, Nanyang,Henan 473003,China;2.General Surgery,Huashan Hospital, Fudan University,Shanghai 200040,China)

ObjectiveTo compare cholesterol nucleation inhibiting activity and concentration of biliary osteopontin(OPN)protein from patients with cholesterol gallstone disease and normal individuals.MethodsBiliary OPN protein were separated and purified from cholesterol gallstone patients and normal individuals using ultracentrifugationmethod combined with gel electrophoresis.Nucleation time and nucleation activity of OPN protein from the two groups were determined by HOLAN method.Concentration of biliary OPN protein of cholesterol gallstone patients and normal individualswere detected by Elisamethod.ResultsCompared with normal individuals, the biliary OPN protein of cholesterol gallstone patients had shorter nucleation time(17.7±1.07 vs 20.4±1.90)d,and weaker cholesterol crystal nucleation inhibiting activity.Biliary OPN protein concentration in cholesterol gallstone patients were lower than in normal individuals(69.60±5.41 vs 82.08±5.63)ng/ml,the differences were statistically significant(P＜0.05).ConclusionsComparing with normal individuals,cholesterol gallstone patients have lower biliary OPN concentration and weaker cholesterol nucleation inhibiting activity.

cholesterol gallstone;osteopontin;anti-nucleation activity

R 657.4

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.24.008

1005-8982（2016）24-0039-04

2016-02-26

國家自然科學(xué)基金：（No：81270536）

陳進(jìn)宏，E-mail：jinhongch@hotmail.com；Tel：13801977742