李同霞，江國(guó)峰，郝文嘉，曹佳偉，蘇海濤，肖謙，王丙瑞

（山東省青島市胸科醫(yī)院1.結(jié)核科，2.檢驗(yàn)科，山東青島266043；3.山東省青島市第九人民醫(yī)院內(nèi)科，山東青島266000；4.山東省無(wú)棣縣佘家鎮(zhèn)衛(wèi)生院，山東無(wú)棣251900）

臨床論著

結(jié)核分枝桿菌臨床分離株利福平和異煙肼耐藥性檢測(cè)方法比較*

李同霞1，江國(guó)峰2，郝文嘉1，曹佳偉2，蘇海濤1，肖謙3，王丙瑞4

（山東省青島市胸科醫(yī)院1.結(jié)核科，2.檢驗(yàn)科，山東青島266043；3.山東省青島市第九人民醫(yī)院內(nèi)科，山東青島266000；4.山東省無(wú)棣縣佘家鎮(zhèn)衛(wèi)生院，山東無(wú)棣251900）

目的探討基因芯片法和改良羅氏培養(yǎng)及比例法藥敏試驗(yàn)在結(jié)核分枝桿菌（MTB）利福平（RFP）和異煙肼（INH）耐藥性測(cè)定中的應(yīng)用價(jià)值。方法應(yīng)用基因芯片法檢測(cè)200株MTB臨床分離株RFP耐藥基因rpoB的6個(gè)位點(diǎn)、13種突變型，INH耐藥基因katG的1個(gè)位點(diǎn)、2個(gè)突變型和INH inhA基因啟動(dòng)子-15位、1個(gè)C→T突變型。同時(shí)對(duì)MTB菌株進(jìn)行羅氏培養(yǎng)及比例法藥敏試驗(yàn)，并比較測(cè)定結(jié)果的敏感性、特異性和符合率。結(jié)果基因芯片法檢測(cè)敏感株152株、耐藥株48株，羅氏比例法檢測(cè)敏感株161株、耐藥株39株。若以羅氏比例法測(cè)定結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn),基因芯片法檢測(cè)RFP耐藥性的敏感性、特異性和符合率分別為85.0%、98.8%和97.5%；檢測(cè)INH耐藥性的敏感性、特異性、符合率分別為82.8%、92.4%和91.0%。結(jié)論基因芯片法對(duì)結(jié)核菌耐藥菌株可做出初篩，與結(jié)核菌藥敏試驗(yàn)聯(lián)合檢測(cè)可提高診斷率。

分枝桿菌，結(jié)核；藥物敏感性；基因芯片；比例法；異煙肼；利福平

據(jù)世界衛(wèi)生組織估算，目前全球已有20億人感染結(jié)核分枝桿菌，每年新發(fā)結(jié)核患者達(dá)1 000萬(wàn)例，約有180萬(wàn)人因結(jié)核病死亡。近年來(lái)，耐藥結(jié)核病疫情日趨嚴(yán)重，已成為結(jié)核病控制困難、死亡率增高的重要原因。利福平（Rifampicin，RFP）和異煙肼（Isoniazid，INH）是治療結(jié)核病的最有效藥物，但是近年來(lái)RFP和INH的耐藥率顯著上升,全國(guó)第5次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查，我國(guó)耐多藥肺結(jié)核現(xiàn)狀不容樂(lè)觀，初始耐多藥率最高地區(qū)10.4%，最低2.1%，獲得性耐多藥率最高地區(qū)36.8%，最低7.9%，總耐多藥率最高16.1%，最低3.5%[1]。因此，快速、準(zhǔn)確地測(cè)定結(jié)核分枝桿菌（MTB）對(duì)RFP和INH的耐藥性已成為有效控制結(jié)核病的關(guān)鍵。目前，改良羅氏培養(yǎng)加藥敏仍是基層醫(yī)院檢測(cè)結(jié)核菌耐藥的主要手段，較Bactec-960價(jià)廉，但是需時(shí)長(zhǎng)；基因芯片技術(shù)日臻成熟，檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)RFP、INH的耐藥性，耗時(shí)少，可大大縮短耐多藥肺結(jié)核的診斷時(shí)間。本研究通過(guò)比較2種檢測(cè)方法，分析其在耐多藥肺結(jié)核診治中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 菌株來(lái)源隨機(jī)選取2013年1月-2014年12月青島市胸科醫(yī)院結(jié)核科門診和住院患者200例。取患者痰液、肺泡灌洗液等為標(biāo)本，按全國(guó)結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)程進(jìn)行分枝桿菌分離培養(yǎng)，菌種鑒定，保存于菌株庫(kù)。所有患者診斷均依據(jù)2006年版《臨床診療指南結(jié)核病分冊(cè)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)確診[2]，經(jīng)痰或肺泡灌洗液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性的結(jié)核病患者。結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv來(lái)自中國(guó)國(guó)家疾控中心。

1.1.2 改良羅氏固體培養(yǎng)基和羅氏比例法藥敏培養(yǎng)基均購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 芯片的制作及檢測(cè)設(shè)備結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒、晶芯Biomixer芯片雜交儀、晶芯Slide WasherTM芯片洗干儀、晶芯Lux Scan 10K-B微陣列芯片掃描儀和Extractor 36核酸快速提取儀均由博奧生物有限公司生產(chǎn)。Bio-rad CFX96 PCR熒光擴(kuò)增儀由美國(guó)伯樂(lè)公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

取出保存于本院菌株庫(kù)中200株MTB臨床分離株,將待檢菌株轉(zhuǎn)種至羅氏培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2周進(jìn)行復(fù)蘇，以H37Rv為標(biāo)準(zhǔn)菌株。

采用羅氏比例法藥敏試驗(yàn)，刮取多處復(fù)蘇菌落，旋緊瓶蓋，在渦旋振蕩器上混旋0.5~1.0min，加入滅菌的PBS緩沖液，直至其濁度與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)瞎埽∕ac Farland NO.1）一致，即得到1mg/ml的菌液。菌懸液靜置片刻，使其中的顆?；蚓鷫K沉淀，用22 SWG標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)或微量吸管無(wú)菌操作逐步稀釋至10-2mg/ml和10-4mg/ml。

用22SWG標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)分別沾取1環(huán)（即0.01m l）10-2mg/ml和10-4mg/ml的菌液，用劃線法均勻接種于含藥培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基斜面，應(yīng)注意使菌液盡可能均勻分散于培養(yǎng)基斜面。最終接種菌量為10-4mg和10-6mg。

接種后的培養(yǎng)基置37℃培養(yǎng)，4周后觀察結(jié)果。RFP耐藥界定濃度為40μg/L，INH耐藥界定濃度為0.2μg/L。

1.3 基因芯片藥敏（DNA微陣芯片法）

用無(wú)菌接種環(huán)挑取一個(gè)肉眼可見(jiàn)復(fù)蘇菌落，置于含有核酸提取液的核酸提取管中。使用Extractor 36核酸快速提取儀振蕩5min，95℃水浴5min，5 000 r/min離心1min。

配置PCR反應(yīng)體系至于Bio-rad CFX96 PCR熒光擴(kuò)增儀，按下列熱循環(huán)程序擴(kuò)增。見(jiàn)附表。

附表 PCR熱循環(huán)程序

取雜交緩沖液9μl，PCR產(chǎn)物各3μl混勻，95℃熱浴5min，使PCR產(chǎn)物變性，隨后立即置于冰水混合物中驟冷3min。取13.5μl雜交溶液經(jīng)加樣孔加入芯片點(diǎn)陣，置雜交儀，50℃雜交2 h后置洗干儀中進(jìn)行洗滌甩干。

將完成洗滌、甩干的芯片插入掃描儀插槽內(nèi)，進(jìn)行芯片掃描和結(jié)果判讀，完成判讀的芯片需室溫避光保存，并詳細(xì)記錄判讀結(jié)果和芯片信息。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以羅氏比例法藥敏結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)[3]，計(jì)算基因芯片法檢測(cè)RFP和INH耐藥性的敏感性及特異性，并比較2種方法的符合率。應(yīng)用χ2檢驗(yàn)比較2種方法的差異性，P>0.05為差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用Kappa檢驗(yàn)對(duì)2種檢測(cè)方法進(jìn)行一致性分析，0.75≤Kappa≤1提示高度一致，0.4≤Kappa<0.75提示中度一致，Kappa<0.4提示低度一致。

2 結(jié)果

2.1 羅氏比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果

以羅氏比例法藥敏試驗(yàn)的結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片法檢測(cè)RFP耐藥的敏感性為85.0%（17/20），特異性為98.9%（178/180），符合率為97.5%（195/200）?；蛐酒z測(cè)INH耐藥的敏感性為82.8%（24/29），特異性為92.4%（158/171），符合率為91.0%（182/200）。總符合率為94.3%（377/400）。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，PRFP=0.866，PINH=0.281，提示這2種方法檢驗(yàn)RFP和INH藥敏結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)Mcnemar檢驗(yàn)，P=1.000，提示2種方法檢驗(yàn)RFP藥敏結(jié)果一致；經(jīng)Mcnemar檢驗(yàn)，P=0.096，提示2種方法檢驗(yàn)INH藥敏結(jié)果一致。

RFP和INH藥敏結(jié)果一致性檢驗(yàn)，Kappa= 0.858，提示2種方法檢驗(yàn)RFP藥敏結(jié)果高度一致；INH藥敏結(jié)果一致性檢驗(yàn)，Kappa=0.710，提示2種方法檢驗(yàn)INH藥敏結(jié)果中度一致。

2.2 基因芯片法檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用基因芯片法檢測(cè)200株MTB臨床分離株RFP耐藥基因rpoB的6個(gè)位點(diǎn)、13種突變型，INH耐藥基因katG的1個(gè)位點(diǎn)、2個(gè)突變型和INHinhA基因啟動(dòng)子-15位、1個(gè)C→T突變型。結(jié)果集中在6個(gè)突變型。具體表現(xiàn)在：rpoB基因突變位點(diǎn)531（C->T）占52.6%（10/19），rpoB基因突變位點(diǎn)526（C->T）占31.6%（6/19），rpoB基因突變位點(diǎn)526（C->G）占15.8%（3/19）。katG基因突變位點(diǎn)315（G->C）占80.0%（16/20），katG基因突變位點(diǎn)315（G->A）占20.0%（4/20），inhA基因突變位點(diǎn)-15（C->T）占100.0%（17/17）。

基因芯片法檢測(cè)結(jié)果，敏感株152株、耐藥株48株，單耐INH結(jié)核菌株占15.0%（30/200），單耐RFP 5.5%（11/200），耐多藥結(jié)核菌株占3.5%（7/200）。羅氏比例法檢測(cè)：敏感株161株、耐藥株39株，單耐INH結(jié)核菌株占9.5%（19/200），單耐RFP 3.5%（7/200）,耐多藥結(jié)核菌株占5.0%（10/200）。

3 討論

近年來(lái)，關(guān)于結(jié)核分枝桿菌耐藥的分子機(jī)制已有一定的進(jìn)展[4-5]，研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌耐藥性的產(chǎn)生與rpoB、katG、inhA、ahpC、ndh、rpsL、rrs、embCAB、PncA等基因突變有關(guān)。大量的研究證實(shí)[6]，RFP耐藥性的發(fā)生是由結(jié)核分枝桿菌編碼RNA聚合酶β亞基的rpoB基因突變所致。PANG等[7]研究發(fā)現(xiàn)，INH耐藥突變主要集中在katG基因和inhA的啟動(dòng)子區(qū)域。本課題所選研究樣本來(lái)自青島市胸科醫(yī)院2013年1月-2014年12月門診和住院患者，從其痰液和肺泡灌洗液中分離培養(yǎng)出結(jié)核菌株，同時(shí)檢測(cè)每株菌株的rpoB、katG、inhA基因是否存在突變。對(duì)RFP的rpoB突變基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示基因芯片檢測(cè)和羅氏比例法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)RFP耐藥性有高度一致性。本研究以羅氏比例法藥敏試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片法檢測(cè)RFP耐藥的敏感性為85.0%，與文獻(xiàn)報(bào)道[8]相近。對(duì)INH的katG、inhA突變基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示2種方法檢測(cè)INH耐藥性結(jié)果中度一致，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相近[8]。以羅氏比例法藥敏試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)基因芯片法檢測(cè)INH耐藥的敏感性為82.8%，略低于文獻(xiàn)報(bào)道[7]。本研究中inhA-15（C->T）突變的菌株較多，但是23.5%的菌株藥敏結(jié)果INH敏感，這也說(shuō)明在結(jié)核分枝桿菌的分子耐藥機(jī)制中inhA突變可能是引起INH耐藥性的一個(gè)因素，但不一定是主要因素[9]，也可能是由于存在本研究檢測(cè)位點(diǎn)外的基因突變。陳楊等[10]報(bào)道，30例藥敏試驗(yàn)?zāi)蚏FP的結(jié)核分枝桿菌中有18株突變分離株，其中4株出現(xiàn)katG和inhA雙基因聯(lián)合突變。而本實(shí)驗(yàn)所分離出的200例菌株中未發(fā)現(xiàn)inhA和katG基因同時(shí)突變的菌株。這需要擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究。

本研究顯示，耐藥基因檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)藥敏試驗(yàn)結(jié)果并非完全一致,與王巍等[11]報(bào)道的相似，一些藥敏試驗(yàn)提示耐藥菌未檢出耐藥基因突變，少數(shù)敏感菌卻檢出了耐藥基因突變，這體現(xiàn)出MTB菌株體外藥敏試驗(yàn)的局限性，也表明結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制具有多樣性和復(fù)雜性，需要繼續(xù)去探索和發(fā)現(xiàn)。

本研究中2號(hào)菌株315（G->A）位點(diǎn)突變，但羅氏藥敏試驗(yàn)RFP和INH及其他一線藥物均敏感，治療3個(gè)月仍菌陽(yáng)，空洞無(wú)縮小，再次痰菌培養(yǎng)RFP和INH仍敏感。調(diào)整治療方案，3個(gè)月后痰菌陰轉(zhuǎn)，空洞閉合。這也表明2種檢測(cè)方法聯(lián)合使用可及早制定出合理有效的治療方案，以減少耐藥菌在社會(huì)上的傳播。

雖然傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)在目前的臨床診療中尚不能被完全取代，基因芯片法仍需要進(jìn)一步研究完善突變位點(diǎn)的檢測(cè)以提高耐藥基因檢測(cè)率，但近年來(lái)的大量研究[7，12]顯示，基因芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)核桿菌耐藥性具有很好的應(yīng)用前景。本研究表明，基因芯片法檢測(cè)RFP和INH耐藥性結(jié)果與傳統(tǒng)的藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果一致性高，可縮短15 d，具有特異性高、符合率高等特點(diǎn)。采用改良羅氏培養(yǎng)方法成本較低，可減少患者的費(fèi)用，再配合基因芯片法檢測(cè)耐藥基因，可早期預(yù)測(cè)結(jié)核菌的耐藥情況。本課題是首次針對(duì)青島市胸科醫(yī)院（青島市結(jié)核病定點(diǎn)收治醫(yī)院）臨床分離的結(jié)核菌株進(jìn)行的研究，可用于指導(dǎo)本地區(qū)臨床，及早制定出合理的抗結(jié)核方案，同時(shí)對(duì)周圍地區(qū)的結(jié)核病防治也有指導(dǎo)意義。

[1]陳誠(chéng),李仁忠,陳明亭,等.全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查及各省耐藥監(jiān)測(cè)中耐藥結(jié)核病疫情資料分析[J].疾病監(jiān)測(cè),2013,28(4): 265-268.

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（張西倩編輯）

Com parison of twomethods detect of M ycobacterium tuberculosis clinical isolates resistance to rifam pin and isoniazid*

Tong-xia Li1,Guo-feng Jiang2,Wen-jia Hao1,Jia-wei Cao2,Hai-tao Su1, Qian Xiao3,Bing-ruiWang4
(1.Department of tuberculosismedicine,2.Department of Laboratory,Qingdao Chest Hospital, Qingdao,Shandong 266043,China;3.Qingdao Ninth People's Hospital,Qingdao,Shandong 266000,China;4.Clinical Laboratory,ShandongWudi County Shejia Central Hospital,Wudi,Shandong 251900,China)

ObjectiveTo evaluate the use of gene chip,Lowenstein-Jensen(L-J)culturemethod and proportion method in detecting Mycobacterium tuberculosis(MTB)resistantof rifampinc(RFP)and isoniazid(INH).MethodsA total of 200 MTB clinical isolates were chosed,6 sites of resistant gene rpoB and 13 kinds ofmutant of RFP were detected,and 1 site of resistantgene katG,2 kinds ofmutant and inhA gene promoter-15,1 kind of C→Tmutantof INH were detected.Meanwhile drug susceptibility of the 200 MTB clinical isolateswith rapid culture and proportion method were detected.Then the sensitivity,specificity and accuracy were compared.ResultsA number of 152 sensitive isolates and 48 resistant isolates were detected by gene chip,and 161 sensitive isolates and 39 resistant were isolated by proportion method.If the result of proportion method was set as criteria,the sensitivity,specificity and accuracy of gene chip test RFP drug were 85%,98.9%and 97.5%,for INH they were 82.8%,92.4%,91%.ConclusionsGene chip method can be used to preliminarily screen the drug-resisitant strains of Mycobacterium tuberculosis.Joint detection with proportionmethod can improve the diagnostic rate.

mycobacterium tuberculosis;drug susceptibility;gene chip;proportionmethod;isoniazid；rifampin

R 446.5；R 52

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.24.005

1005-8982（2016）24-0024-04

2016-02-19

青島市科技局公共領(lǐng)域科技支撐計(jì)劃課題（No：13-1-3-65-nsh）

江國(guó)峰，E-mail：qdxkyy@126.com；Tel：15653267267