林江，溫先勇，林雁，鄧正華，黃遠(yuǎn)帥

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川瀘州646000）

基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)建立的假絲酵母菌快速檢測(cè)方法*

林江，溫先勇，林雁，鄧正華，黃遠(yuǎn)帥

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川瀘州646000）

目的基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）建立一種假絲酵母菌的快速檢測(cè)方法。方法依據(jù)假絲酵母屬18SrDNA基因保守序列，采用PrimerExplorerV4軟件設(shè)計(jì)引物，建立LAMP擴(kuò)增方法和反應(yīng)體系，對(duì)體系的4種關(guān)鍵參數(shù)和3項(xiàng)性能指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化和探討，并用臨床樣本進(jìn)行方法驗(yàn)證。結(jié)果6種常見(jiàn)假絲酵母菌LAMP法檢測(cè)均為陽(yáng)性；最適擴(kuò)增條件為：溫度63～65℃、Bst酶活性4IU、Mg2+濃度4mol/L、擴(kuò)增時(shí)間1h；7種對(duì)照菌種及人全血DNA樣本LAMP擴(kuò)增結(jié)果均為陰性；檢測(cè)限為102～107CFU/ml。經(jīng)52例臨床樣本驗(yàn)證，該法敏感性為100%，特異性為95%。結(jié)論該研究建立的LAMP假絲酵母菌檢測(cè)方法具有實(shí)用、簡(jiǎn)便、快速、特異和敏感的特點(diǎn)，可為臨床提供一種新的假絲酵母菌診斷方法。

假絲酵母菌；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；檢測(cè)方法

近年來(lái)，由于廣譜抗生素的使用、侵襲性技術(shù)廣泛開(kāi)展及免疫力低下人群的不斷增加，真菌感染的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，其中常見(jiàn)假絲酵母菌（白色假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌及季假絲酵母菌）感染已占了真菌感染的85%~91%[1]。實(shí)驗(yàn)室常用診斷方法為培養(yǎng)和組織病理學(xué)方法，該類(lèi)方法耗時(shí)長(zhǎng)、陽(yáng)性率低、有創(chuàng)性，遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足臨床需要。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)，近期在細(xì)菌和病毒研究領(lǐng)域中發(fā)展迅速，但真菌研究方面的資料卻不多見(jiàn)。為此，本研究根據(jù)LAMP基本原理建立假絲酵母菌快速檢測(cè)方法，旨在為臨床快速檢測(cè)假絲酵母菌提供一種手段。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株及對(duì)照菌株

實(shí)驗(yàn)菌株：白色假絲酵母菌（2.4159）、熱帶假絲酵母菌（2.1028）、近平滑假絲酵母菌（2.4312）、克柔假絲酵母菌（2.3196）、光滑假絲酵母菌（2.3983）、季也蒙假絲酵母菌（2.3204）；對(duì)照菌株：大腸埃希菌（1.8732）、金黃色葡萄球菌（1.8721）、銅綠假單胞菌（1.10712）、肺炎克雷伯菌（1.10617），以上菌株由中科院微生物研究所提供；隱球菌、毛霉菌、青霉菌由西南醫(yī)科大學(xué)微生物室提供。

臨床樣本：共52份（假絲酵母菌感染樣本32份，非假絲酵母菌感染樣本20份），標(biāo)本包括為血液、膿液、腦脊液、分泌物等，選取2015年2月-2016年5月西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液內(nèi)科、腫瘤科、感染科、ICU病房、新生兒科急門(mén)診患者，感染菌種經(jīng)鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)、組織病理學(xué)、影像學(xué)、血清學(xué)及臨床資料證實(shí)。

1.2 主要試劑與儀器

DNA提取試劑盒（深圳凱杰生物有限公司公司），朗報(bào)脫氧核糖核酸擴(kuò)增試劑盒、朗報(bào)熒光目視檢測(cè)試劑盒[榮研生物科技（中國(guó)）有限公司]，血瓊脂培養(yǎng)基、巧克力選擇培養(yǎng)基、沙保弱培養(yǎng)基（重慶龐通醫(yī)療器械有限公司）。恒溫水浴鍋（成都賽可隆機(jī)械設(shè)備有限公司），1300seriesA2生物安全柜（蘇州賽摩飛世爾儀器有限公司），高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)THERMO公司），HB-100恒溫金屬浴鍋（杭州博目科技有限公司），C1000梯度PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)白樂(lè)有限公司），WD-9403L紫外分析儀、DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）。

1.3 引物設(shè)計(jì)

針對(duì)6種臨床常見(jiàn)假絲酵母菌（白色假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌、季也蒙假絲酵母菌），依據(jù)其18SrDNA基因序列，使用primerexplorer.jp/elamp4.0軟件在線(xiàn)設(shè)計(jì)LAMP引物，并由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 假絲酵母菌屬LAMP引物序列

1.4 菌株DNA提取

活化冷凍保存（-80℃）菌株恢復(fù)培養(yǎng)，將菌株接種至沙保若培養(yǎng)基（血平板），非假絲酵母菌屬源真菌于28℃、假絲酵母（或細(xì)菌）于37℃，培養(yǎng)2～5d。挑取一定量的單個(gè)純菌落至1.0ml的無(wú)菌生理鹽水EP管中。將上述EP管中的菌懸液按10倍倍比稀釋至所需濃度（以平板傾注培養(yǎng)法驗(yàn)證稀釋后各管濃度并進(jìn)行濃度調(diào)整）。采用凱杰公司DNA提取試劑盒對(duì)模板DNA進(jìn)行提取，操作步驟按說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格進(jìn)行。

1.5 LAMP方法的建立及驗(yàn)證

1.5.1 LAMP擴(kuò)增體系組成參照榮研產(chǎn)品試劑盒說(shuō)明書(shū)，建立LAMP反應(yīng)體系（26.0μl）：2×LAMP反應(yīng)緩沖液12.5μl，4種設(shè)計(jì)引物（25.0μmol/L的FIP和BIP各1.6μl，5μmol/L的F3和B3各1.0μl），BstDNA聚合酶1.0μl，熒光染料1.0μl，純水補(bǔ)至24.0μl。陰陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)體系：2×LAMP反應(yīng)緩沖液12.5μl，BstDNA聚合酶1.0μl，熒光染料1.0μl，2.5μl模板，純水補(bǔ)至24.0μl。實(shí)驗(yàn)組加入已制備的DNA模板液2.0μl，陰陽(yáng)對(duì)照組各加入去離子水和陽(yáng)性對(duì)照液各2.0μl。擴(kuò)增條件：65℃水浴1h，80℃、5min滅活BstDNA聚合酶終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)果用紫外線(xiàn)觀察（或肉眼），陽(yáng)性顯示為亮綠色熒光，陰性無(wú)熒光（橙紅色）。

1.5.2 LAMP方法的驗(yàn)證利用1.5.1建立的方法對(duì)6種假絲酵母菌屬常見(jiàn)菌種進(jìn)行LAMP擴(kuò)增后肉眼觀察結(jié)果。

1.6 反應(yīng)體系優(yōu)化

根據(jù)設(shè)計(jì)引物的理論退火溫度值，選擇溫度（56、59、62、65、68、71、74和77℃）、Bst酶活性（8IU、4IU）、Mg2+濃度（2、4和6mmol/L）及反應(yīng)時(shí)間（30、45、60和90min）等參數(shù)，以白色假絲酵母DNA為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，以確定最佳反應(yīng)條件。

1.7 LAMP方法特異性、敏感性及檢測(cè)限的檢測(cè)

1.7.1 LAMP方法特異性利用建立的LAMP方法對(duì)1.1中的6種實(shí)驗(yàn)菌株、4種對(duì)照菌株、3種非假絲酵母真菌菌株以及人全血DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，以評(píng)估建立LAMP方法的特異性。

1.7.2 LAMP方法的敏感性及檢測(cè)限將白色假絲酵母菌培養(yǎng)，按1.4方法稀釋?zhuān)苽?00～107CFU/m l濃度的菌懸液，以建立的LAMP體系進(jìn)行擴(kuò)增，觀察檢測(cè)敏感性和檢測(cè)限。

1.8 LAMP方法的臨床樣本驗(yàn)證

對(duì)臨床證實(shí)的假絲酵母菌感染樣品32份及其他細(xì)菌感染樣品20份進(jìn)行傳統(tǒng)培養(yǎng)和LAMP擴(kuò)增檢測(cè)，比較其陽(yáng)性率、敏感性及特異性的差異。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LAMP快速檢測(cè)方法采用敏感性、特異性等指標(biāo)加以評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 6種常見(jiàn)假絲酵母菌LAMP檢測(cè)結(jié)果

利用建立的LAMP擴(kuò)增體系對(duì)白色假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌、季也蒙假絲酵母菌等6種假絲酵母菌擴(kuò)增，熒光觀察見(jiàn)圖1，結(jié)果見(jiàn)表2所示，6種常見(jiàn)假絲酵母菌均呈陽(yáng)性。

2.2 LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化

圖1 6種常見(jiàn)假絲酵母菌LAMP擴(kuò)增熒光效果圖

表2 6種假絲酵母菌LAMP擴(kuò)增結(jié)果

反應(yīng)溫度、Bst酶濃度、Mg2+濃度、反應(yīng)時(shí)間等參數(shù)優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖2~5。圖2顯示，在71～77℃內(nèi)產(chǎn)物熒光極弱；在56～68℃溫度范圍內(nèi)熒光明亮，其中在63～65℃熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，故確定LAMP擴(kuò)增適宜溫度為63～65℃。圖3顯示，在最適65℃溫度條件下，Bst酶濃度分別為8 IU、4 IU LAMP擴(kuò)增熒光觀察結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因成本因素，確定LAMP擴(kuò)增采用4 IU Bst酶。圖4顯示，在65℃退火溫度和4 IU Bst酶活性條件下，Mg2+濃度分別為2、4和6mmol/L時(shí)，以Mg2+濃度為4mmol/L時(shí)熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。圖5顯示，在65℃，4 IU Bst酶活性、4mmol/L的Mg2+濃度條件下，反應(yīng)時(shí)間分別為30、45、60和90min時(shí)，60和90min熒光強(qiáng)度均強(qiáng)，為縮短反應(yīng)時(shí)間，故選擇60min為適宜擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間。

2.3 LAMP方法的特異性、敏感性和檢測(cè)限

2.3.1 LAMP方法特異性6種假絲酵母菌和7種對(duì)照菌株及人全血DNA LAMP擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖6，其電泳結(jié)果見(jiàn)圖7，結(jié)果顯示，6種假絲酵母菌及陽(yáng)性對(duì)照均呈陽(yáng)性；對(duì)照菌株、人全血DNA及陰性對(duì)照均呈陰性；由于LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物是由多種大小不同片段組成，電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增結(jié)果符合LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物特征。

圖2 溫度對(duì)LAMP擴(kuò)增影響熒光效果圖

圖3 Bst酶活性對(duì)LAMP擴(kuò)增影響熒光效果圖

2.3.2 LAMP方法敏感性及檢測(cè)限將按1.4方法稀釋、提取的白色假絲酵母菌模板進(jìn)LAMP擴(kuò)增，熒光結(jié)果（見(jiàn)圖8）顯示，102～107CFU/ml濃度的模板均表達(dá)為強(qiáng)熒光，檢測(cè)范圍為102～107CFU/ml。見(jiàn)表3。

圖4 Mg2+濃度對(duì)LAMP擴(kuò)增影響熒光效果圖

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)LAMP擴(kuò)增影響熒光效果圖

圖6 假絲酵母菌對(duì)照菌株及人全血DNALAMP擴(kuò)增結(jié)果

圖7 LAMP特異性檢測(cè)電泳效果圖

2.4 LAMP方法的臨床樣本驗(yàn)證

對(duì)經(jīng)臨床證實(shí)的32份假絲酵母菌及20份非假絲酵母菌感染樣品分別進(jìn)行培養(yǎng)和LAMP檢測(cè)，其結(jié)果見(jiàn)表4。

表4顯示，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法比較，LAMP檢測(cè)法陽(yáng)性率（χ2=9.861，P=0.000）和敏感性均有提高（χ2=19.591，P=0.000），檢測(cè)時(shí)間為1.5～2.0h，也遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于培養(yǎng)法的24～48h。

圖8 LAMP敏感性檢測(cè)熒光效果圖

表3 LAMP擴(kuò)增不同濃度梯度DNA模板檢測(cè)結(jié)果

表4 臨床樣品培養(yǎng)與LAMP檢測(cè)結(jié)果比較（n=52）

3 討論

真菌屬于人體正常菌群，當(dāng)人免疫力降低時(shí)容易造成感染，而其中假絲酵母菌占絕大部分[2]。由于該病起病隱匿，早期診斷困難，病情進(jìn)展迅速，死亡率高[3]，所以臨床上迫切需要一種早期、快速的真菌檢測(cè)方法。

LAMP技術(shù)是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一種分子診斷技術(shù)，它依賴(lài)于鏈置換酶（Bst酶）在恒溫水浴鍋條件下快速、高效的擴(kuò)增核酸，具有廣泛的應(yīng)用前景[4]。

LAMP擴(kuò)增技術(shù)成敗的關(guān)鍵是引物設(shè)計(jì)。由于真核生物核糖體DNA（rDNA）的不同基因和區(qū)段（18 S、28 S、5.8 S、ITS）具有高度保守性，常用于真菌菌屬的鑒定[5-6]。筆者依據(jù)Genbank提供的假絲酵母18S基因保守序列，采用LAMP在線(xiàn)引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)針對(duì)假絲酵母屬的外引物F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP等4種特異性引物，經(jīng)過(guò)本實(shí)驗(yàn)6種常見(jiàn)假絲酵母菌均能呈現(xiàn)LAMP特異性擴(kuò)增，而其他細(xì)菌如金黃色葡萄球群、肺炎雙球群、銅綠假單胞菌、大腸桿菌及3種非假絲酵母菌屬的真菌（新型隱球菌、毛霉菌）及人全血DNA樣本均未見(jiàn)LAMP特異擴(kuò)增。

LAMP反應(yīng)體系中溫度、BstDNA聚合酶、Mg2+濃度、擴(kuò)增時(shí)間等，對(duì)擴(kuò)增都有重要影響：溫度通過(guò)影響反應(yīng)體系酶的活性來(lái)影響擴(kuò)增效率，筆者根據(jù)4種引物的退火溫度范圍，設(shè)計(jì)了涵蓋56～77℃范圍內(nèi)8個(gè)溫度在C1000梯度PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行溫度梯度實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，反應(yīng)在退火溫度高于70℃時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)量低，在退火溫度為63~65℃時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物量最大。由于Bst酶的最佳活性溫度范圍為60～65℃，溫度過(guò)高或相對(duì)過(guò)低都可能影響鏈置換酶活性使擴(kuò)增產(chǎn)量下降，所以最適溫度應(yīng)以63～65℃為宜。酶活性的高低可決定反應(yīng)時(shí)間和擴(kuò)增產(chǎn)物量。Mg2+以dNTP-Mg形式參與核酸骨架相互作用，并且可在一定程度上影響B(tài)st酶的活性，兩者常常相互作用。實(shí)驗(yàn)中根據(jù)Bst酶、Mg2+濃度對(duì)擴(kuò)增效率的影響分別設(shè)計(jì)8IU、4IU和2、4和6mmol/L的濃度梯度，當(dāng)Bst酶濃度減半至4IU后與Bst酶8IU的擴(kuò)增效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Mg2+濃度設(shè)置為4mmol/L時(shí)，LAMP擴(kuò)增效率最高。考慮到Bst酶成本，選用Bst酶4IU、Mg2+4mmol/L為反應(yīng)體系適宜濃度。時(shí)間對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物量有較大影響。本實(shí)驗(yàn)中設(shè)置的4個(gè)時(shí)間梯度內(nèi)，擴(kuò)增顯示在30和45min已有較明顯的擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)，60和90min2個(gè)時(shí)間段內(nèi)LAMP均出現(xiàn)較強(qiáng)熒光，為了縮短檢測(cè)時(shí)間，確定適宜擴(kuò)增時(shí)間為60min。

由于4種LAMP引物是針對(duì)靶序列6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)的，在6個(gè)區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配時(shí)均不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增，本實(shí)驗(yàn)顯示假絲酵母菌各菌種均能進(jìn)行特異的LAMP反應(yīng)，敏感性達(dá)到102CFU/ml，與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)略有差異[7]，為PCR的10倍。

通過(guò)對(duì)52份臨床樣品的培養(yǎng)和LAMP檢測(cè)證實(shí)，除6種實(shí)驗(yàn)假絲酵母菌菌種外，產(chǎn)朊假絲酵母、清酒假絲酵母、馬鈴薯假絲酵母等3種少見(jiàn)的假絲酵母菌菌種也能檢出，而臨床標(biāo)本中，除7種對(duì)照菌種外，其他細(xì)菌對(duì)檢測(cè)干擾很小（僅1例真菌有擴(kuò)增，與假絲酵母菌基因同源性高），LAMP方法在陽(yáng)性率、敏感性明顯優(yōu)于培養(yǎng)法。

與其他核酸擴(kuò)增技術(shù)相比，LAMP技術(shù)特異、敏感，儀器設(shè)備要求低，操作簡(jiǎn)單，肉眼可直接觀察，更適合基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)開(kāi)展[8-9]。但由于敏感性高，防污染極為關(guān)鍵，否則，可能出現(xiàn)假陽(yáng)性[6]。其不足之處是只能鑒定到假絲酵母菌菌屬，但已可及時(shí)指導(dǎo)臨床對(duì)患者的針對(duì)性治療。LAMP技術(shù)的應(yīng)用和推廣，為進(jìn)一步臨床研究和臨床早期確診真菌感染和降低患者死亡率、提高患者預(yù)后提供了新的檢測(cè)手段。

[1]張文,柏彩英,周強(qiáng),等.血培養(yǎng)真菌的菌種分布及耐藥性分析[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2012,33(15):1889-1990.

[2]孔丹莉,周浩,王茜,等.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)血液中白色念珠菌[J].廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,29(6):600-601.

[3]廖萬(wàn)清,陳敏.侵襲性真菌病的診斷:現(xiàn)狀與展望[J].菌物學(xué)報(bào),2011,30(1):5-11.

[4]張宇,郭良棟.真菌DNA條形碼研究進(jìn)展[J].菌物學(xué)報(bào),2012,31(6):809-820.

[5]周均亮,趙瑞琳.真菌DNA條形碼技術(shù)研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào),2013,40(8):1468-1477.

[6]魯勇,王一萍,應(yīng)建飛,等.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)臨床假絲酵母菌屬方法建立與應(yīng)用[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2015,25(6): 1204-1206.

[7]GHOSH R,NAGAVARDHINI A,SENGUPTA A,et al.Development of loop-mediated isothermal amplification(LAMP)assay for rapid detection of Fusarium oxysporum,f.sp.ciceris,-wilt pathogen of chickpea[J].Bmc Research Notes,2015,8(1):1-10.

[8]路超,王長(zhǎng)印,董振芳,等.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用[J].分子診斷與治療雜志,2011,3(2):138-144.

[9]DUAN Y B,GE C Y,ZHANG X K,et al.Development and evaluation of a novel and rapid detection assay for Botrytis cinerea based on loop-mediated isothermal amplification[J].Plos One,2014,9(10):e111094.

（張蕾編輯）

Establishment of loop-mediated isothermal am p lification forrapid detection of candida spp*

Jiang Lin,Xian-yongWen,Yan Lin,Zheng-hua Deng,Yuan-shuaiHuang
(Department of Laboratory Medicine,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China)

ObjectiveTo establish a rapid detection of candida spp on the basis of loop-mediated isothermal method.MethodsAccording to the gene bank,18 S rDNA gene sequence was provided.Primer Explorer V4 online design software design for the Candida genus-specific primers was used,and LAMP expansion method and the reaction system was set up.Four key parameters for the system and three performance were optimized and discussed, and then verified by clinical samples.ResultsSix kinds of candida were all positive,and the optimum temperature was 63℃-65℃,the activity of Bstwas 4 u,concentration of Mg2+was 4 mM,time was 1 h.All 7 kinds of clinical reference strains and Human whole blood DNA samples amplification results were negative.The detection limitwas 107-102 CFU/ml.A total of 52 cases of clinical samples proved that the method sensitivity was 100%,and the specificity was 95%.ConclusionsThemethod of the genus candida established by LAMP technology is significantly practical,simple,rapid,specific and sensitive.

candida;loop-mediated isothermal amplification;detectionmethods

R-331

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.24.002

1005-8982（2016）24-0006-05

2016-06-21

西南醫(yī)科大學(xué)青年科技基金（No：2014QN-102）