朱善軍，倪曉艷，吳巧珍，沈國(guó)榮，陸靜芬，朱同華，沈 昊，馬春芳

(南通大學(xué)附屬吳江區(qū)第一人民醫(yī)院，江蘇 吳江 215200)

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吳江地區(qū)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯酶基因攜帶情況及同源性

朱善軍，倪曉艷，吳巧珍，沈國(guó)榮，陸靜芬，朱同華，沈 昊，馬春芳

(南通大學(xué)附屬吳江區(qū)第一人民醫(yī)院，江蘇 吳江 215200)

目的 了解吳江地區(qū)臨床分離多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(MDRAB)碳青霉烯酶基因攜帶情況和同源性。方法收集吳江地區(qū)3所綜合性醫(yī)院2010年1月—2013年12月臨床分離的非重復(fù)MDRAB 44株，測(cè)定其最低抑菌濃度(MIC)；采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增碳青霉烯酶基因OXA-51、OXA-23、OXA-24、OXA-58、IMP、TEM、SHV和GES，脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分析菌株同源性。結(jié)果44株MDRAB主要來(lái)源標(biāo)本為痰(占93.18%)，主要分布在重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)、呼吸科和神經(jīng)外科，各占45.45%、27.27%和13.64%；MDRAB對(duì)米諾環(huán)素和多粘菌素B均敏感，對(duì)哌拉西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢他啶、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星耐藥率均為100.00%，對(duì)亞胺培南和美羅培南耐藥率均為97.73%。44株MDRAB均檢出OXA-51、OXA-23和TEM基因，其中12株菌GES基因陽(yáng)性，OXA-58和SHV基因陽(yáng)性各1株，未檢測(cè)到OXA-24及IMP基因；MDRAB分為A—G 7個(gè)型別，分別為19、3、9、3、1、4、5株。A型主要來(lái)源于吳江地區(qū)的兩所大型綜合性醫(yī)院(吳江第一人民醫(yī)院和盛澤醫(yī)院)，吳江第一人民醫(yī)院未發(fā)現(xiàn)B、D和E型；E型僅1株，分布在永鼎醫(yī)院，其余型別散在分布。結(jié)論吳江地區(qū)臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥嚴(yán)重，基因OXA-23和TEM是鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥的主要原因，并以A、C型為主，呈克隆性傳播。

鮑曼不動(dòng)桿菌； 碳青霉烯酶基因； 多重耐藥； 脈沖場(chǎng)凝膠電泳； PFGE

[Chin J Infect Control，2016，15(12)：913-916,933]

鮑曼不動(dòng)桿菌是醫(yī)院感染的重要條件致病菌，其感染日益增多，僅次于銅綠假單胞菌和大腸埃希菌[1]。隨著廣譜抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等的應(yīng)用，以及介入性醫(yī)療操作的廣泛展開(kāi)，使多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(multidrug-resistantAcinetobacterbaumannii，MDRAB)的臨床分離率日益增高[2]，其引起的醫(yī)院感染已成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題[3]。為了解吳江地區(qū)臨床分離的MDRAB的耐藥現(xiàn)狀，探討其流行趨勢(shì)、耐藥機(jī)制及同源性，對(duì)吳江地區(qū)3所綜合性醫(yī)院臨床分離的44株MDRAB進(jìn)行相關(guān)研究，以期為控制和預(yù)防耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集2010年1月—2013年12月吳江地區(qū)3所綜合性醫(yī)院(吳江第一人民醫(yī)院、盛澤醫(yī)院、永鼎醫(yī)院)各類(lèi)臨床標(biāo)本分離的44株非重復(fù)的MDRAB，所有菌株均經(jīng)法國(guó)梅里埃API細(xì)菌鑒定系統(tǒng)或VITEK 2全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853和金黃色葡萄球菌ATCC 29213。

1.1.2 抗菌藥物 包括亞胺培南、美羅培南、頭孢他啶、頭孢吡肟、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、多粘菌素B、哌拉西林、米諾環(huán)素和氨芐西林/舒巴坦。

1.1.3 儀器與試劑 VITEK 2鑒定儀(法國(guó)生物梅里埃公司)、SDS-PAGE電泳儀(美國(guó)Bio-Rad 3000XI公司)、9600型基因擴(kuò)增儀(美國(guó)PE公司)、凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、CHEF-MAPPER 脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供)；MH瓊脂購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司，DNA提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司，DNA marker購(gòu)自大連寶生物公司，其余均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；引物由南京生興生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn) 采用瓊脂稀釋法測(cè)定12種抗菌藥物的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，結(jié)果判定按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2012年標(biāo)準(zhǔn)[4]進(jìn)行。

1.2.2 耐藥基因檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[5]合成引物，見(jiàn)表1。細(xì)菌基因組提取步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。PCR反應(yīng)體系為：Taq Mix 25 μL，引物各1 μL，模板1 μL，用Rnase Free dH2O 補(bǔ)至50 μL。擴(kuò)增參數(shù)為94 ℃ 5 min，然后94 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s 進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 7 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像系統(tǒng)中拍照。

表1 目的基因PCR擴(kuò)增引物序列

Table 1 Primer sequences of PCR amplification for targeted genes

目的基因引物序列擴(kuò)增片段大小(bp)OXA-51P1:5’-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’353P2:5’-TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’OXA-23P1:5’-TGTGCTGGTTATTCAAAC-3’216P2:5’-ATGGCTTCTCCTAGTGTC-3’OXA-24P1:5’-TGACTTTAGGTGAGGCAATG-3’223P2:5’-AAAGGTAATCGGTTATGTGC-3’OXA-58P1:5’-TATGGCACGCATTTAGAC-3’509P2:5’-AAACCCACATACCAACCC-3’IMPP1:5’-CATGGTTTGGTGGTTCTTGT-3’582P2:5’-ATAATTTGGCGGACTTTGGC-3’SHVP1:5’-GGTTATGCGTTATATTCGCC-3’865P2:5’-TTAGCGTTGCCAGTGCTC-3’GESP1:5’-ATTTGCTGATTTCGCTCGG-3’392P2:5’-TTAGCGTTGCCAGTGCTC-3’TEMP1:5’-ATCAGCAATAAACCAGC-3’516P2:5’-CCCCGAAGAACGTTTTC-3’

1.2.3 脈沖場(chǎng)凝膠電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE)分型 將35 ℃培養(yǎng)過(guò)夜的細(xì)菌用低熔點(diǎn)膠灌模，蛋白酶K消化48 h，限制性?xún)?nèi)切酶Apa I酶切12 h，電泳條件為1%瓊脂糖膠，0.5×TBE 緩沖液，14℃，6 V/cm，120°，脈沖時(shí)間5～20 s，電泳22 h后EB染色，紫外燈下觀(guān)察結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)參考Tenvoer分型方法：大多數(shù)流行病學(xué)相關(guān)帶型大小和數(shù)量相同的菌株被認(rèn)為是同一類(lèi)型；由于突變、插入、缺失或倒置的遺傳改變?cè)陔娪編蜕吓c主要表型有3個(gè)或3個(gè)以下差別的菌株被認(rèn)為是同一型別的不同亞型；帶型中有4或4個(gè)以上不同之處不能用1次或2次遺傳變化解釋的，被認(rèn)為是不同型別。

2 結(jié)果

2.1 MDRAB來(lái)源標(biāo)本及科室 MDRAB標(biāo)本來(lái)源：41株(93.18%)來(lái)源于痰標(biāo)本，其余3株分別來(lái)自腦脊液、導(dǎo)管和胸腔積液。MDRAB主要分布于重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)、呼吸科、神經(jīng)外科和急診科，分別占45.45%、27.27%、13.64%、9.09%。

2.2 藥敏結(jié)果 MDRAB對(duì)米諾環(huán)素和多粘菌素B均敏感，對(duì)哌拉西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢他啶、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星耐藥率為100.00%，對(duì)亞胺培南和美羅培南均為97.73%。見(jiàn)表2。

表2 44株MDRAB對(duì)11種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.3 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 44株MDRAB均檢出OXA-51、OXA-23和TEM基因，其中12株菌GES基因陽(yáng)性，OXA-58和SHV陽(yáng)性各1株，未檢測(cè)到OXA-24及IMP基因。見(jiàn)圖1。

M：DNA marker；A1—8泳道：OXA-23基因陽(yáng)性；A9—11泳道：OXA-51基因陽(yáng)性；B1—4泳道分別為GES、TEM、SHV、OXA-58基因陽(yáng)性

圖1 MDRAB耐藥基因PCR擴(kuò)增電泳圖

Figure 1 Electrophoresis map of PCR amplification products of MDRAB drug-resistant genes

2.4 PFGE分型 MDRAB分為A—G 7個(gè)型別，分別為19、3、9、3、1、4、5株。A、C型可分成2個(gè)亞型，A1亞型11株，A2亞型8株，C1亞型5株，C2亞型4株。A型主要來(lái)源于吳江地區(qū)的兩所大型綜合性醫(yī)院(吳江第一人民醫(yī)院和盛澤醫(yī)院)，吳江第一人民醫(yī)院未發(fā)現(xiàn)B、D和E型，E型僅1株，分布在永鼎醫(yī)院，其余型別散在分布。見(jiàn)圖2、表3。

圖2 部分MDRAB的PFGE結(jié)果

Table 3 PFGE genotyping and distribution of 44 MDRAB strains

醫(yī)院PFGE型別(株)A1A2BC1C2DEFG吳江第一人民醫(yī)院560320021盛澤醫(yī)院521102013永鼎醫(yī)院102121111合計(jì)1183543145

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌是醫(yī)院感染的重要病原菌，由該菌引起的醫(yī)院感染和暴發(fā)事件不斷增多[6]。本研究結(jié)果顯示，3所醫(yī)院分離的MDRAB主要來(lái)源于痰標(biāo)本，3所醫(yī)院患者主要為MDRAB引起的下呼吸道感染，與國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道[7]一致；ICU的所占比率最高，可能與患者病情多危重，常并發(fā)嚴(yán)重感染，免疫防御功能低下，且長(zhǎng)期或聯(lián)合使用廣譜抗菌藥物及接受侵入性操作(如氣管插管、靜脈置管)等有關(guān)。

本研究收集的44株MDRAB對(duì)米諾環(huán)素和多粘菌素B均敏感，對(duì)哌拉西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢他啶、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星全耐藥，對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥率>97%，耐藥情況嚴(yán)重；對(duì)氨芐西林/舒巴坦全耐藥可能與舒巴坦復(fù)方制劑的臨床應(yīng)用增多有關(guān)[8]。

鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素的耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，其中產(chǎn)碳青霉烯酶是最主要的耐藥機(jī)制。鮑曼不動(dòng)桿菌中發(fā)現(xiàn)的碳青霉烯酶主要為A、B和D三類(lèi)酶。其中A類(lèi)碳青霉烯酶包括SHV型和GES型；B類(lèi)碳青霉烯酶包括IMP型；D類(lèi)碳青霉烯酶又稱(chēng)OXA型碳青霉烯酶，該類(lèi)酶又根據(jù)其核苷酸序列特點(diǎn)可分為4個(gè)型，分別為基因OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58，因此本研究主要對(duì)上述基因進(jìn)行檢測(cè)。44株MDRAB均攜帶OXA-23、OXA-51和TEM，其攜帶率高于其他文獻(xiàn)報(bào)道[9-11]，其次攜帶率較高的是GES基因，OXA-58和SHV基因陽(yáng)性菌株均僅1株，說(shuō)明本地區(qū)流行的MDRAB可同時(shí)產(chǎn)生多種β-內(nèi)酰胺酶，上述基因可能是本地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥的重要機(jī)制之一，但研究中的產(chǎn)酶株是否伴有其他耐藥機(jī)制，仍有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

PFGE分型是目前國(guó)際上公認(rèn)的病原菌同源分析的金標(biāo)準(zhǔn)。PFGE條帶結(jié)果顯示，44株MDRAB菌株有7種基因型，以A型(19株)和C型(9株)為主，其余型別以散發(fā)形式存在。由于ICU住院患者具有病情重、自身免疫力低下和侵入性操作多等特點(diǎn)，易出現(xiàn)醫(yī)院感染暴發(fā)流行。在研究期間，A型克隆株為ICU主要流行菌株，A1亞型存在時(shí)間跨度最長(zhǎng)，從2010年5月第1次分離，到2013年2月仍有此亞型的臨床分離株出現(xiàn)，提示該克隆株可能長(zhǎng)期存在于ICU，并通過(guò)某種途徑造成交叉感染。本研究未能獲取環(huán)境標(biāo)本，未及時(shí)進(jìn)行追根溯源工作。工作中應(yīng)及時(shí)對(duì)儀器、環(huán)境消毒滅菌，嚴(yán)格執(zhí)行手衛(wèi)生，條件允許時(shí)開(kāi)展對(duì)醫(yī)院暴發(fā)感染的及時(shí)追蹤、分析并切斷傳播途徑，減少和杜絕醫(yī)院感染。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，3所醫(yī)院均檢出A1型克隆，可能與鮑曼不動(dòng)桿菌帶菌患者到多所醫(yī)院就診，導(dǎo)致傳播有關(guān)。結(jié)合臨床資料顯示，吳江第一人民醫(yī)院有2例A1克隆株患者曾于2012年11月2日在盛澤醫(yī)院ICU住院，有1例A1克隆株患者曾于2013年4月23日在永鼎醫(yī)院ICU住院。此時(shí)期3所醫(yī)院存在某種MDRAB的暴發(fā)流行，并可能以克隆株的的形式在病房?jī)?nèi)、病房間，甚至醫(yī)院間進(jìn)行傳播。

綜上所述，克隆播散是MDRAB的主要傳播方式，同時(shí)攜帶OXA-23和TEM多種耐藥基因是鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥的主要原因，臨床MDRAB泛耐藥情況嚴(yán)重且存在院內(nèi)和院間流行，應(yīng)加強(qiáng)醫(yī)護(hù)人員在日常工作中的無(wú)菌觀(guān)念，防止交叉感染，避免克隆株流行。

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(本文編輯：豆清婭)

Carriage and homology of carbapenemase genes of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii in Wujiang

ZHUShan-jun,NIXiao-yan,WUQiao-zhen,SHENGuo-rong,LUJing-fen,ZHUTong-hua,SHENHao,MAChun-fang

(WujiangFirstPeople’sHospital,NantongUniversity,Wujiang215200,China)

Objective To investigate the carriage and homology of carbapenemase genes of multidrug-resistantAcinetobacterbaumannii(MDRAB) in Wujiang area.Methods A total of 44 non-duplicated MDRAB isolated from patients in 3 general hospitals in Wujiang area from January 2010 to December 2013 were collected. Minimum inhibitory concentrations(MICs) were detected, carbapenemase genesOXA-51,OXA-23,OXA-24,OXA-58,IMP,TEM,SHV, andGESwere amplified with polymerase chain reaction(PCR), homology of strains was detected with pulsed-field gel electrophoresis(PFGE).Results 44 MDRAB strains were mainly collected from sputum (93.18%), mainly distributed in intensive care unit (ICU), department of respiratory diseases, and department of neurosurgery, accounting for 45.45%, 27.27%, and 13.64% respectively; MDRAB were both sensitive to minocycline and polymyxin B, resistance rates to piperacillin, ampicillin/sulbactam, ceftazidime, gentamicin, amikacin, and ciprofloxacin were all 100.00%, resistance rates to imipenem and meropenem were both 97.73%. 44 MDRAB strains were all detectedOXA-51,OXA-23 andTEMgenes, 12 strains were positive forGESgene, 1 strain was positive forOXA-58 andSHVrespectively,OXA-24 andIMPgenes were not found ; MDRAB were divided into 7 types of G-A, which included 19, 3, 9, 3, 1, 4, and 5 strains respectively, type A was mainly from two large general hospitals in Wujiang area (Wujiang First People’s Hospital and Shengze Hospital), type B, D and E strains were not detected in Wujiang First People’s Hospital, type E strain was only 1 isolate and was from Yongding Hospital, the other types were sporadically distributed.Conclusion Multidrug resistance of clinically isolatedAcinetobacterbaumanniiis serious in Wujiang area,OXA-23 andTEMgenes are major causes of multidrug resistance inAcinetobacterbaumannii, the main types are A and C, which present clonal spread.

Acinetobacterbaumannii; carbapenemase gene; multidrug resistance; pulsed-field gel electrophoresis; PFGE

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.12.004

2016-03-20

吳江第一人民醫(yī)院基金資助項(xiàng)目(201417)

朱善軍(1984-)，男(漢族)，山東省臨沂市人，檢驗(yàn)技師，主要從事微生物及腫瘤分子診斷研究。

馬春芳 E-mail:njmacf@163.com

R181.3+2 R378.99

A

1671-9638(2016)12-0913-05