牛瑞兵，郭利平，王新剛，段寶生，巴特爾

(鄂爾多斯市中心醫(yī)院，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000)

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·論著·

社區(qū)獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌SCCmec基因分型及藥敏結(jié)果

牛瑞兵，郭利平，王新剛，段寶生，巴特爾

(鄂爾多斯市中心醫(yī)院，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000)

目的 了解某院門診和住院患者標本分離的社區(qū)獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(CA-MRSA)盒式染色體基因(SCCmec)型別以及CA-MRSA耐藥性。方法收集該院2011年5月—2015年8月分離的MRSA及其相關(guān)病史資料，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法進行MRSA的mecA基因和CA-MRSA的SCCmec基因分型檢測，對CA-MRSA進行藥物敏感性試驗并進行統(tǒng)計分析。結(jié)果共收集MRSA 305株，其中mecA陽性296株。CA-MRSA 88株，占29.73%(88/296)，其中48株為SCCmecⅣ型，36株為SCCmecⅤ型，4株未定型。藥敏試驗顯示，CA-MRSA對萬古霉素、利奈唑胺、替加環(huán)素均100%敏感，對青霉素和苯唑西林100%耐藥；SCCmecⅣ和Ⅴ型CA-MRSA對左氧氟沙星、利福平、環(huán)丙沙星的耐藥率比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。SCCmecⅣ、Ⅴ型CA-MRSA對氨芐西林/舒巴坦、呋喃妥因、紅霉素的耐藥率均>58%。結(jié)論該院CA-MRSA的SCCmec分型以Ⅳ和Ⅴ型為主，且耐藥率較高，臨床醫(yī)生應(yīng)對此高度重視,根據(jù)藥敏結(jié)果合理應(yīng)用抗菌藥物。

金黃色葡萄球菌； 社區(qū)獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌； CA-MRSA； SCCmec基因分型； 抗藥性，微生物； 耐藥性； 合理用藥

[Chin J Infect Control，2016，15(12)：897-901]

1961年發(fā)現(xiàn)的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)現(xiàn)在是社區(qū)獲得性感染的重要病原菌，并且感染率有逐年上升的趨勢[1]。與醫(yī)院獲得性MRSA(hospital-acquired MRSA，HA-MRSA)感染不同,社區(qū)獲得性MRSA(community-acquired MRSA，CA-MRSA)感染通常發(fā)生在社區(qū)環(huán)境中，是導(dǎo)致皮膚及軟組織獲得感染的主要因素[2]。MRSA的耐藥機制主要是獲得了外源性葡萄球菌盒式染色體基因(staphylococcal cassette chromosomemec, SCCmec)，其攜帶mecA基因在內(nèi)的多種耐藥基因，SCCmec的結(jié)構(gòu)具有高度多態(tài)性，可分為不同的型[3]。本研究利用多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測MRSA的mecA基因和CA-MRSA的SCCmec基因型，研究鄂爾多斯地區(qū)CA-MRSA的基因型及藥物敏感情況，為預(yù)測發(fā)展趨勢，控制暴發(fā)流行，治療CA-MRSA感染提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集鄂爾多斯市中心醫(yī)院2011年5月—2015年8月門診和住院患者微生物標本分離鑒定的MRSA 305株，所有菌株均為非重復(fù)菌株，同一患者同一部位只取1次分離株。MRSA的篩查用VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定儀，所用質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC 25923購于衛(wèi)生部臨床檢驗中心。用PCR方法檢測mecA基因確定MRSA 296株。

1.1.2 CA-MRSA的診斷 符合以下條件的為CA-MRSA感染[3]：患者在門診就診時MRSA培養(yǎng)陽性或在入院48 h內(nèi)MRSA培養(yǎng)陽性；患者無MRSA感染或定植的病史；患者在過去一年中無住院史，無外科手術(shù)史，無護理中心入住史，無透析史，患者無永久留置的管腔或經(jīng)皮膚進入體內(nèi)的醫(yī)療裝置。

1.1.3 主要試劑及儀器 細菌基因組提取試劑盒、溶葡球菌酶、2×Taq PCR Master Mix、ddH2O、100 bp DNA Ladder、瓊脂糖、核酸染料均購于南京博爾迪生物科技有限公司。實驗所有引物序列由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。BioRad公司PCR擴增儀(PTC-200)，北京六一儀器廠DYY-6C型電泳儀，英國Syngene公司電泳成像分析系統(tǒng)。法國VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定儀及藥敏系統(tǒng)，藥敏卡及培養(yǎng)基全部購于北京威泰科生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MRSA基因組DNA模板提取 將已凍存的菌株重新接種于哥倫比亞血平板上，置37℃溫箱中孵育18～24 h。用滅菌環(huán)從血平板上挑取8～10個復(fù)活菌落置于300 μL含溶葡球菌酶液中，置37℃溫箱中水浴30 min，取出放入100℃沸水中小火煮10 min，12 000 r/mim離心5 min，其余方法按照細菌DNA提取試劑盒的操作進行，提取DNA置于-20℃冰箱中保存。

1.2.2mecA基因檢測 參照文獻[4]合成mecA基因擴增引物:MECAP4：5’-TCCAGATTACAACTTCACCAGG-3’，MECAP7：5’-CCACTTCATATCTTGTAAGG-3’，擴增片段大小約為162 bp。采用PCR方法對初篩的MRSA進行分子學檢測，攜帶mecA基因的確定為MRSA菌株。PCR擴增體系為25 μL，其中DNA模板2 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，MECAP40.25 μL，MECAP70.25 μL，余ddH2O補足。PCR擴增條件為94℃初變性4 min，94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，最后72℃延伸4 min，1.5%瓊脂糖電泳，EB染色，紫外凝膠成像儀觀察目的條帶，并拍照成像。

1.2.3 CA-MRSA菌株SCCmec基因分型 參照2007年Milheirico等[5]方法設(shè)計10對引物，采用多重PCR的方法對CA-MRSA菌株進行SCCmec基因分型，所用引物見表1。反應(yīng)體系為25 μL，其中DNA模板2 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，各種引物的最終濃度和用量參考文獻，余ddH2O補足。PCR擴增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。取10 μL PCR產(chǎn)物點樣，在 1.8%瓊脂糖凝膠中電泳1 h，結(jié)果拍照保存。

1.2.4 藥物敏感試驗 采用VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏系統(tǒng)對分離的CA-MRSA進行16種抗菌藥物的敏感性試驗。結(jié)果判定采用美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)2005年版標準進行。

1.3 統(tǒng)計學分析 所收集數(shù)據(jù)應(yīng)用WHONET 5.2軟件和SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行分析，CA-MRSA SCCmecⅣ型和SCCmecⅤ型耐藥率比較采用χ2檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 CA-MRSA菌株SCCmec基因分型所用引物

2 結(jié)果

2.1 CA-MRSA標本來源 根據(jù)臨床診斷共獲得88株CA-MRSA，來自于皮膚科、骨科、普通外科、兒科、腫瘤科、重癥監(jiān)護病房(ICU)、神經(jīng)外科等12個科室，其中以兒科、皮膚科和骨科所占比率最高。見圖1。

圖1 88株CA-MRSA來源科室分布

2.2 MRSA菌株多重PCR鑒定結(jié)果 經(jīng)多重PCR擴增，擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖成像顯示，305株MRSA 中mecA基因陽性296株。見圖2。

2.3 CA-MRSA菌株SCCmec基因分型結(jié)果 利用多重PCR方法對88株CA-MRSA進行SCCmec基因分型，48株為SCCmecⅣ型，36株為SCCmecⅤ型，4株未定型。見圖3。

M: DNA ladder maker(100～1 500 bp)；1—11泳道：臨床MASA菌株；-:陰性對照

圖2mecA基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

Figure 2 Electrophoresis map of PCR amplification products ofmecA gene

M: DNA ladder maker(100～1 500 bP)；1—15：CA-MRSA菌株；-:陰性對照；其中1、2泳道菌株SCCmec分型未定型，3、4、9、10號菌株為SCCmecⅤ型，5—8、11—15號菌株為SCCmecⅣ型

圖3 CA-MRSA菌株SCCmec基因分型電泳圖

Figure 3 Electrophoresis map of CA-MRSA SCCmecgenotyping

2.4 CA-MRSA藥敏結(jié)果 84株SCCmec分型的CA-MRSA對萬古霉素、利奈唑胺、替加環(huán)素均100%敏感，對青霉素和苯唑西林100%耐藥；SCCmecⅣ型和SCCmecⅤ型CA-MRSA對左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、利福平的耐藥率比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，對其余9種抗菌藥物的耐藥率均相對較高。SCCmecⅣ型和SCCmecⅤ型CA-MRSA對氨芐西林/舒巴坦的耐藥率分別為66.67%、69.44%，對呋喃妥因的耐藥率分別為62.50%、58.33%，對紅霉素的耐藥率分別為66.67%，69.44%。見表2。

表2 不同SCCmec基因型CA-MRSA對抗菌藥物的耐藥情況[株(%)]

3 討論

MRSA既是醫(yī)院獲得性感染，也是社區(qū)獲得性感染的主要病原菌之一。雖然醫(yī)療技術(shù)在高速發(fā)展，但MRSA感染率及病死率一直居高不下。根據(jù)文獻[6]報道，從20世紀90年代開始CA-MRSA感染在國內(nèi)外的不同地區(qū)均十分嚴峻，甚至發(fā)生暴發(fā)流行。SCCmec基因分型是研究CA-MRSA菌株基因型變化或流行病學的最常用方法，也是區(qū)分HA-MRSA和CA-MRSA感染的一種重要檢測方法[7]。

本研究顯示，鄂爾多斯市中心醫(yī)院門診與病房標本分離的296株MRSA中，根據(jù)病史資料CA-MRSA為88株，占29.73%。感染標本主要來源于兒科和皮膚科、骨科，說明CA-MRSA主要感染兒童、健康人群，且以感染皮膚軟組織為主。根據(jù)SCCmec分型主要分為兩個型別，分別是SCCmecⅣ型和SCCmecⅤ型，其中SCCmecⅣ型48株，SCCmecⅤ型36株，與國內(nèi)其他地區(qū)的文獻[8]報道結(jié)果基本一致。而李敏豪等[9]的研究表明，CA-MRSA的SCCmec分型為Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ型，可能是由于地理區(qū)域不同，導(dǎo)致的CA-MRSA的基因分型有所不同，也可能是由于病史資料的統(tǒng)計方法不同，致使一部分HA-MRSA判斷為CA-MRSA。本實驗中的4株未定型CA-MRSA可能為SCCmec亞型，需要進一步鑒定。

MRSA耐藥機制主要是由于編碼青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)的基因發(fā)生變化所致。MRSA的多重耐藥特點與擁有的SCCmec結(jié)構(gòu)存在聯(lián)系。SCCmec主要有5個型別, HA-MRSA基因型別為SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ型, CA-MRSA 基因型別多為Ⅳ型和Ⅴ型。SCCmec基因型與 MRSA 的流行背景有關(guān), 不同地區(qū)的 SCCmec可能不同, 不同遺傳背景的克隆株攜帶的 SCCmec也可能不同，同時耐藥也存在顯著差異[10]。HA-MRSA通常多重耐藥嚴重，對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素等多種抗菌藥物耐藥，通常僅對糖肽類敏感，目前萬古霉素是其最后一道防線[11]。CA-MRSA除mecA基因外很少攜帶其他耐藥基因，但隨著抗菌藥物的頻繁使用，CA-MRSA對各類抗菌藥物的耐藥性也在不斷增強。

本研究顯示，84株CA-MRSA對青霉素和苯唑西林100%耐藥，但未發(fā)現(xiàn)對萬古霉素、利奈唑胺、替加環(huán)素的耐藥菌株。SCCmecⅣ型和SCCmecⅤ型CA-MRSA對左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、利福平的耐藥率比較，差異有統(tǒng)計學意義，且耐藥率比較低，對其余9種抗菌藥物的耐藥率均無差別，且耐藥率相對偏高。說明不同的SCCmec基因型別的菌株對抗菌藥物的耐藥性有一定的差別，可能是由于不同的SCCmec基因攜帶了不同的耐藥基因所致[12]。在美國，克林霉素是皮膚軟組織感染門診治療的推薦用藥[13]，而本地區(qū)克林霉素耐藥率高達50%，說明在門診治療中要根據(jù)具體情況選擇合適的抗菌藥物。本實驗中Ⅳ型和Ⅴ型CA-MRSA對大多數(shù)抗菌藥物的耐藥率均較劉小麗等[8]的研究要高，對氨芐西林/舒巴坦的耐藥率分別為66.67%、69.44%，對呋喃妥因的耐藥率分別為62.50%、58.33%，對紅霉素的耐藥率分別為66.67%，69.44%，說明本地區(qū)CA-MRSA的耐藥性比較嚴重。在臨床治療CA-MRSA感染過程中可聯(lián)合使用耐藥率較低的左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、利福平，防止耐藥率的升高，同時不宜根據(jù)經(jīng)驗用藥，要根據(jù)實驗室的藥物敏感性合理應(yīng)用抗菌藥物。

綜述所述，本院CA-MRSA感染流行較嚴重，耐藥率較高，臨床醫(yī)生應(yīng)引起高度重視。

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(本文編輯：左雙燕)

SCC mec genotyping and antimicrobial susceptibility of community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus

NIURui-bing,GUOLi-ping,WANGXin-gang,DUANBao-sheng,BATe-er

(OrdosCentralHospital,Ordos017000,China)

Objective To investigate the types of staphylococcal cassette chromosomemec(SCCmec) gene and antimicrobial resistance of community-acquired methicillin-resistantStaphylococcusaureus(CA-MRSA) isolated from outpatients and inpatients in a hospital.Methods MRSA strains isolated between May 2011 and August 2015 in a hospital and the relevant case data were collected, polymerase chain reaction(PCR) method was used to identifymecA gene of MRSA and SCCmecgene of CA-MRSA, antimicrobial susceptibility testing of CA-MRSA were performed and analyzed.Results A total of 305 MRSA isolates were collected, 296 of which weremecA positive, 29.73%(88/296) were CA-MRSA. The genotyping of CA-MRSA showed that 48 strains were SCCmectype Ⅳ, 36 were SCCmectype V, the other 4 strains were undefined. Antimicrobial susceptibility testing results showed that susceptibility rates of CA-MRSA to vancomycin, linezolid, and tigecycline were all 100%, resistance rates to penicillin and oxacillin were both 100%; resistance rates of SCCmectype IV and SCCmectype V CA-MRSA strains to levofloxacin, rifampicin, and ciprofloxacin were all significantly different (allP<0.05), to ampicillin/sulbactam, furantoin, and erythromycin were all >58%.Conclusion The main SCCmectype of CA-MRSA are type IV and type V in this hospital, antimicrobial resistance rate is high, clinicians should pay high attention, and use antimicrobial agents according to antimicrobial susceptibility testing results.

Staphylococcusaureus; community-acquired methicillin-resistantStaphylococcusaureus; CA-MRSA; SCCmecgenotyping; drug resistance, microbial; rational antimicrobial use

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.12.001

2016-06-25

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學基金面上項目(2013MS1116)；內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生和計劃生育委員會醫(yī)療衛(wèi)生科研計劃項目(201302161)

牛瑞兵(1986-)，男(漢族)，山西省興縣人，主管檢驗師，主要從事微生物與免疫學疾病的研究。

段寶生 E-mail:erdsdbs@163.com

R378.1+1 R969.3

A

1671-9638(2016)12-0897-05