孫成龍 黃立佳 黃楊 鄒陽 王昌興?

細(xì)胞聯(lián)合生物支架治療脊髓損傷的研究進展

孫成龍 黃立佳 黃楊 鄒陽 王昌興?

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）的發(fā)生已成為全球性的醫(yī)療難題，現(xiàn)今國內(nèi)外研究的重點及熱點在于如何克服再生屏障，修復(fù)受損組織，促進脊髓再生。1987年正式提出組織工程學(xué)概念，其基本原理是將少量種子細(xì)胞體外培養(yǎng)擴增后，聯(lián)合生物材料，修復(fù)損傷脊髓組織，改善生理功能。目前眾多實驗室研究也致力于聯(lián)合生物支架與細(xì)胞，使其發(fā)揮互補協(xié)同作用，取長補短共同促進軸突再生和功能恢復(fù)。本文回顧了近年來以細(xì)胞載體為基礎(chǔ)復(fù)合組織工程支架在SCI修復(fù)中的具體應(yīng)用及其優(yōu)勢與局限性，旨在為進一步臨床研究提供理論依據(jù)。

1 學(xué)術(shù)背景

SCI不僅可以造成感覺及運動障礙，而且可以導(dǎo)致多系統(tǒng)功能紊亂，包括心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和泌尿生殖系統(tǒng)［1］。世界范圍內(nèi)患有SCI的患者約有2500萬，而且據(jù)報道每年病例新增人數(shù)已＞13萬［2］。SCI的病理生理機制是多因素的，包括血管破裂、局部缺血缺氧和水腫、炎癥因子滲出、自由基形成等，這些因素共同導(dǎo)致?lián)p傷區(qū)域內(nèi)神經(jīng)元破壞、軸突退化、髓鞘脫失、空洞和膠質(zhì)瘢痕的形成［3］。

過去幾十年間，有關(guān)于SCI的研究呈爆發(fā)性增長，大量的實驗室研究都致力于向臨床實驗轉(zhuǎn)化［4］，從而指導(dǎo)臨床診治。然而現(xiàn)今針對脊髓橫斷患者的功能恢復(fù)尚無顯著有效的治療措施［5］。臨床上針對SCI現(xiàn)有的治療方法例如促神經(jīng)生長藥物的應(yīng)用，手術(shù)減壓，康復(fù)訓(xùn)練和中藥熏洗等物理療法，而這些方法對軸突連續(xù)性中斷所導(dǎo)致的神經(jīng)元靶源性營養(yǎng)供給減少和生理電信號及化學(xué)傳遞功能受損的作用甚小，因此雖有一定療效，但不能從本質(zhì)上阻止病情發(fā)展。藥理學(xué)研究表明，大劑量強的松龍沖擊療法對于急性損傷有一定療效［6］，但是由于其副作用較明顯，在臨床上應(yīng)用受到較大限制。因此針對SCI帶來的一系列問題，新的治療手段顯得尤為重要。

隨著近年來組織工程學(xué)的迅速發(fā)展，利用種子細(xì)胞移植修復(fù)受損神經(jīng)為SCI的研究與治療提供了新思路，與此同時多種生物材料用于制成可移植細(xì)胞的載體系統(tǒng)或?qū)Ч苤Ъ?，其發(fā)揮橋梁作用治療SCI的研究與應(yīng)用也受到業(yè)內(nèi)人士的廣泛關(guān)注。大量實驗研究表明，具有生物相容性的支架作為細(xì)胞載體移植入宿主體內(nèi)后，能夠為種子細(xì)胞提供一個相對良好穩(wěn)定的環(huán)境，且有利于大量血管形成并長入支架內(nèi)，能夠使移植的細(xì)胞獲取充分的養(yǎng)分并利于其代謝產(chǎn)物的排出?；诖耍疚膶Σ煌N類的細(xì)胞與支架聯(lián)合治療脊髓損傷的優(yōu)勢及其局限性作一綜述，同時對支架承載細(xì)胞的聯(lián)合治療相比于其獨立移植是否更有助于脊髓損傷的恢復(fù)進行討論，旨在為進一步實驗室研究和臨床研究提供參考。

2 細(xì)胞聯(lián)合生物支架治療脊髓損傷

盡管分別以細(xì)胞和支架為基礎(chǔ)治療SCI的實驗基礎(chǔ)已趨于成熟，其單一療法仍然存在較多局限性。采用支架單一治療時，不能按照預(yù)期精確的調(diào)整支架性能，移植到體內(nèi)的支架也不能替代受損細(xì)胞和組織達到良好的修復(fù)。另一方面，細(xì)胞單獨移植時無法重建脊髓組織復(fù)雜的構(gòu)架及穩(wěn)定性，亦不能誘導(dǎo)軸突再生［7］。聯(lián)合支架和細(xì)胞移植治療SCI不僅能克服諸多再生障礙，而且能發(fā)揮良好的協(xié)同作用利于損傷后功能的恢復(fù)，下面回顧了近年來最常見的聯(lián)合治療方法。

2.1 神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs） SCI模型中植入的NSCs可以替代神經(jīng)元，促進髓鞘再生從而有利于功能恢復(fù)。近年來研究表明人工合成的多聚羥基乙酸（PGA），聚乳酸（PLA）及其共聚物（PLGA）作為細(xì)胞載體共同移植至SCI模型中具有廣泛的應(yīng)用前景［8］。究其生物學(xué)基礎(chǔ)，現(xiàn)有研究表明NSCs聯(lián)合PLGA培養(yǎng)14d后，細(xì)胞存活并廣泛分布于支架孔隙中，細(xì)胞中＞70%為微管相關(guān)蛋白2（Map2）免疫陽性細(xì)胞，且突觸后密度蛋白95（PSD95），突觸蛋白-I（Synapsin-I）免疫染色顯示突觸結(jié)構(gòu)形成，說明PLGA支架誘導(dǎo)了NSCs分化為神經(jīng)元，有效建立了突觸連接［9］。JC［10］團隊用靈長類動物獼猴的NSCs與自制多鈦納米纖維支架共培養(yǎng)后移植入SCI大鼠模型中，電鏡下觀察NSCs在支架的誘導(dǎo)下分化成神經(jīng)細(xì)胞，膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，且運動功能評分（BBB）顯示聯(lián)合治療組相對于細(xì)胞組和支架組單獨治療，其后肢活動功能明顯提高，差異統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而細(xì)胞組和支架組的評分未見顯著差異。

一些研究已證實天然聚合物充當(dāng)生物支架可以對NSCs進行調(diào)節(jié)。比如，藻朊酸鹽海綿或凝膠能有效抑制脊髓橫斷損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生，減少瘢痕形成，有利于軸突的再生［11］。與大鼠海馬組織衍生出的神經(jīng)球細(xì)胞共移植后，可觀察到細(xì)胞存活、分化、長距離遷移，并與宿主脊髓組織融為一體［12］。與之相似，纖維蛋白凝膠也能大幅度促進軸突和樹突再生［13］。

2.2 間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs） MSCs已成為近年來公認(rèn)理想的種子細(xì)胞之一，具有多分化潛能，經(jīng)大量培養(yǎng)擴增，在特定的化學(xué)或生物誘導(dǎo)環(huán)境下可以分化成神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞等。聯(lián)合生物材料也成為組織工程學(xué)的一種有效治療方法，旨在增加損傷部位細(xì)胞的移植效率與存活率。例如，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）與PLGA共移植明顯增強了SCI后的功能恢復(fù)，可見損傷部位的神經(jīng)絲蛋白陽性細(xì)胞密度增加［14］。在PLGA與小腸黏膜下層的復(fù)合支架（PLGA/SIS）上種植hBMSCs亦能起到誘導(dǎo)神經(jīng)再生的作用［15］。另有研究將MSCs標(biāo)記在具有三維立體結(jié)構(gòu)的明膠海綿（GS）支架上，驗證了明膠海綿作為一種可靠的生物工程材料，在修復(fù)受損神經(jīng)組織方面具有良好的細(xì)胞適應(yīng)性和組織相容性［16］。Wang等［17］模擬脊髓的多孔三維結(jié)構(gòu)制作了殼聚糖支架，聯(lián)合神經(jīng)營養(yǎng)因子-3（NT-3）和BMSCs植入全橫斷大鼠脊髓損傷處，通過術(shù)后行為學(xué)測試，電生理和組織學(xué)評估證實了聯(lián)合治療相比于單純支架組治療更有利于損傷后的軸突再生和功能恢復(fù)。在臨床應(yīng)用方面，Sherif M. Amr等［18］在14例慢性SCI導(dǎo)致截癱的患者身上應(yīng)用腓腸神經(jīng)作為斷端橋接，聯(lián)合殼聚糖-層粘連蛋白和BMSCs移植至損傷空洞處，顯示患者的運動及感覺水平均有不同程度的提高，根據(jù)美國脊髓損傷協(xié)會（ASIA）評分標(biāo)準(zhǔn)，運動功能的改善中，有2例患者提高了4個等級，另12例患者提高了2個等級；在感覺功能的提高方面，有2例患者提高了6個等級，5例患者提高了5個等級，3例患者提高了4個等級，4例患者提高3個等級。下肢肌群包括大腿部屈肌群、內(nèi)收肌群、伸膝肌群以及踝背屈肌的力量也有不同程度的提高，這些結(jié)果與之前將未種植細(xì)胞的腓腸神經(jīng)支架移植研究相比較具有顯著優(yōu)勢，然而這種程度的功能恢復(fù)仍不足以使患者主動站立或行走，提示支架聯(lián)合細(xì)胞移植目前在臨床方面的應(yīng)用處于初級探索階段，而其應(yīng)用前景不可估量。

2.3 雪旺細(xì)胞 （SCs） SCs是促進外周神經(jīng)損傷后修復(fù)的主要因素，因此人們將其應(yīng)用于SCI后軸突與髓鞘再生的修復(fù)。實驗室研究證明SCs直接移植到受損脊髓損傷部位后，斷端接觸面上無明顯炎癥反應(yīng)，且脊髓兩斷端之間可見髓鞘再生，然而其傳導(dǎo)功能恢復(fù)程度有限［19］，因為軸突的再生難以通過損傷處的囊性空腔或者膠質(zhì)瘢痕，而聯(lián)合支架的應(yīng)用使這一難題得到解決。曾有學(xué)者應(yīng)用載有纖連蛋白、海藻酸鹽和新生兒SCs的聚羥基丁酸酯（PHB）導(dǎo)管植入脊髓半橫斷大鼠，發(fā)現(xiàn)軸突能夠再生并穿過脊髓植入物平面［20］，由此驗證支架的聯(lián)合應(yīng)用彌補了細(xì)胞移植的眾多不足。Bamber等［21］將聚丙烯腈與聚氯乙烯（PAN/PVC）以60∶40的比例制成一種半透微管支架，其作用不僅可以引導(dǎo)軸突的再生方向，而且通過微管可以傳遞神經(jīng)營養(yǎng)因子并限制瘢痕纖維侵入。SCs種植在支架上后觀察到來自脊髓近端及遠(yuǎn)端方向的神經(jīng)元軸突延伸入植入物中，并在兩斷端之間形成有效橋接，但是長入移植物的神經(jīng)突觸不能或者僅極少數(shù)能夠通過遠(yuǎn)端移植物的脊髓平面。Fouad等［22］也使用了類似的方法將SCs種植于60∶40的PAN/PVC孔徑里，結(jié)果可見BBB運動評分有了顯著提高，移植物內(nèi)有血管長入，SCs誘導(dǎo)橋接的再生軸突數(shù)量亦可見增加。但由于PAN/PVC支架不可吸收，可能會對遠(yuǎn)期神經(jīng)再生有所限制，以及產(chǎn)生異物免疫反應(yīng)。因此可吸收生物支架的應(yīng)用有效的避免了不良反應(yīng)，早在2001年就有研究應(yīng)用SCs種植在聚乳酸制成圓柱狀支架上嵌在脊髓斷端之間，結(jié)果在支架分解前再生神經(jīng)纖維的數(shù)量及髓鞘化較好，而隨著支架急劇降解，再生纖維數(shù)量開始減少，由此說明支架的幾何形態(tài)改變對于神經(jīng)再生是有影響甚至是不利的。

2.4 嗅鞘細(xì)胞（OECs） OECs能夠顯著促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元的再生，并且減少神經(jīng)凋亡，減輕膠質(zhì)瘢痕的形成，同時分泌血管內(nèi)皮生長因子等一系列營養(yǎng)因子，且有助于脊髓損傷部位的髓鞘再生和郎飛結(jié)的形成。這些特性使其成為聯(lián)合治療SCI的良好種子細(xì)胞。先前研究培養(yǎng)OECs并將其懸浮液注入脊髓受損組織中，發(fā)現(xiàn)再生軸突僅能覆蓋較小面積的病變組織，而與PLGA共培養(yǎng)移植后，具有生物結(jié)構(gòu)相似的支架發(fā)揮了橋梁作用，使得OECs促進的軸突生長能夠覆蓋較大面積的受損組織。Bing-Cang Li等［23］在體外測試了PLGA支架與OECs的兼容性，顯示完全相容。二者的組合能夠顯著改善受損坐骨神經(jīng)的結(jié)構(gòu)和功能，并有效防止脊髓神經(jīng)壞死。Novikova等［24］進行的一項體外研究測試了OECs與不同水凝膠之間的生物相容性。與藻朊酸鹽水凝膠結(jié)合，OECs呈現(xiàn)不規(guī)則的球形，且其代謝活動受到抑制，而在藻朊酸鹽中加入纖連蛋白后，細(xì)胞的增殖分化等代謝活動則明顯增強。當(dāng)OECs與人工基底膜共培養(yǎng)時，細(xì)胞的增殖擴散受到明顯刺激并可觀察到其特有的細(xì)胞形態(tài)。另一體外實驗探究了納米纖維凝膠材料IKVAV多肽的自組裝及其與OECs的相容性。倒置顯微鏡結(jié)果顯示不管種植在支架2D還是3D的表面，OECs都能存活，遷移并粘附在支架上，且與多聚懶氨酸共培養(yǎng)相比，OECs的數(shù)量、生存能力和細(xì)胞形態(tài)無明顯差異［25］。Fengyu Qi 等結(jié)合了導(dǎo)電性聚吡咯與殼聚糖觀察其對于OECs的作用，結(jié)果顯示無論有無電刺激，聚吡咯/殼聚糖聚合物支架均利于細(xì)胞粘附、擴散和增殖。給予支架電刺激后，研究者們發(fā)現(xiàn)腦源性神經(jīng)生長因子（BDNF）、神經(jīng)生長因子（NGF）、神經(jīng)細(xì)胞粘附分子（N-CAM）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達及分泌均顯著提高，而神經(jīng)突產(chǎn)物抑制劑A（NOGO-A）的分泌及表達水平與未加入電刺激時相比則明顯降低［26］。這一報道也證明了電刺激可以調(diào)節(jié)OECs的功能，包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和神經(jīng)營養(yǎng)因子的釋放等，使得具有導(dǎo)電性質(zhì)的高分子聚合物為組織工程學(xué)的進一步研究開辟了良好前景。Amaia Ferrero-Gutierrez等［27］為了測試脊髓損傷后大鼠運動功能的恢復(fù)情況，在損傷部位植入了新鮮血漿衍生的白蛋白支架與OECs混合物，結(jié)果顯示聯(lián)合支架與細(xì)胞的治療組大鼠與單純支架治療組相比較，不同時間點的BBB評分均顯著提高，另外，損傷部位聯(lián)合治療組的星形膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘢痕形成顯著減少，細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元和軸突的標(biāo)記物表達量可見增多。

3 問題與前景

單純的細(xì)胞移植后軸突生長較紊亂，而生物支架的作用在于為近端新生的軸突提供有效支持與導(dǎo)向，為細(xì)胞生長提供三維的機械支撐并引導(dǎo)細(xì)胞的遷移、增殖、分化以及凋亡，且能保護新生軸突免受瘢痕組織侵害。然而支架的細(xì)胞移植可能引起機體免疫排斥反應(yīng)，供體部位壞死，以及傳播疾病等不足，另外支架本身也有其不足，例如聚乳酸PLA導(dǎo)管的弱點在于過快水解，改良后的共聚物PLGA雖性質(zhì)更優(yōu)，但仍難以控制其本身降解速率，且制作塑型過程較復(fù)雜，體內(nèi)降解的酸性產(chǎn)物對局部微環(huán)境可能產(chǎn)生不良影響。因此在SCI治療的相關(guān)實驗研究雖取得了巨大進步，但離臨床的廣泛應(yīng)用仍有距離，臨床上可能面臨支架材料降解之后的細(xì)胞環(huán)境改變問題，不可降解材料術(shù)后二次取出問題，或是載體留置及崩塌問題等?？陀^分析，結(jié)合生物支架與細(xì)胞的優(yōu)點，盡可能克服或改善各自的不足，其前景仍良好。另外，如何降低移植后可能存在的免疫反應(yīng)，使移植至缺損處的細(xì)胞定向分化為功能性結(jié)構(gòu)所需的細(xì)胞仍是目前亟待研究的課題。

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國家自然科學(xué)基金項目（編號：81271355）

310000 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（孫成龍 黃立佳 黃楊）310000 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院（鄒陽 王昌興）

*通信作者