王雨 吳克楓 俞紅 劉泳廷 劉佳

(貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550004)

野生水芹的急性毒性及遺傳毒性研究

王雨 吳克楓 俞紅 劉泳廷 劉佳

(貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550004)

野生水芹； 急性毒性； 遺傳毒性

野生水芹[Oenanthe javanica (BI．) DC．簡稱水芹]，隸屬于傘形科水芹屬，又名楚葵、野芹菜，為多年水生宿根草本植物[1]。近年來國內(nèi)外學(xué)者對水芹的活性成分開展分析并通過動物藥理實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，水芹含有揮發(fā)油類、甾醇類、醇類、脂肪酸類、黃酮類等成分，在抗肝炎、抗心律失常、抗糖尿病和降血壓、降血脂等方面具有多方面用途，被認(rèn)為是一種優(yōu)質(zhì)的保健蔬菜[2-3]，但其毒性研究少見報(bào)道，本研究為探討水芹安全性，選用了急性毒性和遺傳毒性試驗(yàn)對其進(jìn)行毒理學(xué)檢測。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

水芹由市場購得，選用地上可食部分，洗凈晾干后放入70 ℃通風(fēng)式烘箱中干燥至恒質(zhì)量，粉碎過100目篩，放置干燥器中備用。1 g干粉等于13 g水芹鮮重。實(shí)驗(yàn)中劑量均指鮮重。

本研究所用動物為SPF級昆明小鼠，購自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK(黔)2012-0001，動物質(zhì)量合格證號：小鼠0201504、0201211，購進(jìn)動物適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，輻照滅菌清潔級飼料由蘇州雙獅實(shí)驗(yàn)動物飼料科技有限公司提供。飼料合格證號為蘇飼審(2009)05032。動物房為屏蔽環(huán)境，溫度18～24 ℃，濕度40%～70%。實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號SYXK(黔)2014-001。

1.2 主要儀器及試劑

生物顯微鏡、手術(shù)器械、恒溫培養(yǎng)箱、高壓滅菌器、恒溫水浴搖床、電子天平、全自動菌落計(jì)數(shù)儀、常規(guī)試劑。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

參照中華人民共和國衛(wèi)生部2003年《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》[4]。

1.3.1 急性毒性實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)采用最大耐受劑量法。選用體質(zhì)量為18～22 g昆明種小鼠20只，雌雄各半。根據(jù)急性毒性劑量分級標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)劑量設(shè)為15 g/(kg·bw)灌胃前禁食16 h，灌胃后連續(xù)觀察兩周，記錄動物中毒表現(xiàn)及死亡情況。

1.3.2 Ames試驗(yàn) 采用平板摻入法，測試菌株為TA97、TA98、TA100、TA102，經(jīng)鑒定各種生物學(xué)特性均符合要求。受試物劑量為8、40、200、1 000、5 000 μg/皿，同時(shí)設(shè)自發(fā)回變、溶劑對照和陽性對照，在加和不加S9混合液的條件下分別進(jìn)行測試。整套試驗(yàn)在相同條件下重復(fù)做兩次。

1.3.3 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn) 選用昆明種小鼠50只，體質(zhì)量25～30 g，隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半，以環(huán)磷酰胺50 mg/(kg·bw)劑量為陽性對照，蒸餾水為陰性對照，試驗(yàn)組高、中、低3個劑量分別為10.00 g/(kg·bw)、5.00 g/(kg·bw)、2．50 g/(kg·bw)。采用間隔24 h兩次經(jīng)口灌胃法進(jìn)行試驗(yàn)，于第2次給予受試物后6 h頸椎脫臼處死動物，取胸骨制片，甲醇固定，Giemsa染色，每只動物油鏡下觀察1 000個嗜多染紅細(xì)胞(PCE)中出現(xiàn)的微核細(xì)胞數(shù)，計(jì)算微核率(‰)，計(jì)數(shù)200個PCE的同時(shí)計(jì)數(shù)觀察到的正染紅細(xì)胞(NCE)數(shù)，并計(jì)算PCE/NCE比值。

1.3.4 小鼠精子畸形試驗(yàn) 選用體質(zhì)量25～35 g雄性昆明種小鼠25只，隨機(jī)分為5組，每組5只，以環(huán)磷酰胺50 mg/(kg·bw)劑量為陽性對照，蒸餾水為陰性對照。實(shí)驗(yàn)組高、中、低3個劑量分別為10.00 g/(kg·bw)、5.00 g/(kg·bw)、2．50 g/(kg·bw)連續(xù)5 d經(jīng)口灌胃給予受試物，于首次灌胃后35 d頸椎脫臼處死動物，取雙側(cè)附睪制片，伊纖染色，每只小鼠觀察1 000個完整精子，計(jì)算精子畸形率(%)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 急性毒性試驗(yàn)

以15 g/(kg·bw)劑量的水芹灌胃20只小鼠(雌雄各半)，未觀察到實(shí)驗(yàn)動物出現(xiàn)中毒癥狀和死亡，樣品MTD>15 g/(kg·bw)屬急性無毒級。

2.2 Ames試驗(yàn)

自發(fā)回變、溶劑對照菌落數(shù)均在正常范圍，加與不加S9混合液的受試物各劑量組的回變菌落數(shù)與陰性對照組的回變菌落數(shù)之比(MR)均<2，亦無劑量-反應(yīng)關(guān)系，而陽性對照組與溶劑對照組的回變菌落數(shù)之比>2。表明水芹無誘 導(dǎo)TA97、TA98、TA100、TA102回復(fù)突變能力，見表1，2。

劑量/(μg/皿)TA97-S9+S9TA98-S9+S9TA100-S9+S9TA102-S9+S98161±34132±1739±349±5154±36144±39304±63325±5640140±42133±32 17±1442±2163±46157±66282±98295±56200132±33124±1224±830±8155±45183±20287±33353±741000167±35200±1325±7 31±22168±58167±45327±47287±465000156±39161±4424±4 32±13175±37162±53357±31263±44蒸餾水170±25148±2733±638±4186±14189±8 248±32263±34DMSO151±24149±1738±840±4155±17158±18289±20288±14敵克松2284±2121137±84 MMS3116±936108±3772?AAF1743±1416567±4503011±1201．8?二羥基蒽醌899±163

劑量/(μg/皿)TA97-S9+S9TA98-S9+S9TA100-S9+S9TA102-S9+S98145±31176±3126±238±9128±13175±47316±67 328±10240140±29133±3223±839±9120±21135±30334±32285±16200134±50161±3429±739±4179±34140±28289±11319±291000140±31183±29 37±1119±8138±30130±32329±63320±465000208±22134±1631±642±9150±21142±25314±42302±76蒸餾水159±9166±934±747±4193±7 181±12285±28273±42DMSO149±17150±1938±839±8152±17146±16282±31262±22敵克松268±1471859±530MMS3144±1216254±3872?AAF1666±134 6187±1283272±4581．8?二羥基蒽醌?873±124

2.3 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)

各劑量組微核率與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，陰性對照組與環(huán)磷酰胺組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。各組PCE/NCE值均在正常值范圍內(nèi)。故在本試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性，見表3。

性別劑量/[g/(kg·bw)]動物數(shù)/只觀察PCE數(shù)/個含微核PCE數(shù)/個微核率/‰PCE/NCE2．505500081．60±0．891．64±0．175．005500081．60±0．551．60±0．25雄性10．0055000102．00±1．222．33±0．84陰性對照55000112．20±1．102．26±0．63環(huán)磷酰胺55000172 34．40±10．41?1．40±0．832．505500081．60±0．551．90±0．335．005500051．00±0．001．69±0．23雌性10．005500081．60±0．551．64±0．20陰性對照5500061．20±0．452．04±0．54環(huán)磷酰胺5500018436．80±6．98?1．15±0．62

注:與陰性對照組比較，*P<0．01。

2.4 小鼠精子畸形試驗(yàn)

陰性對照組與環(huán)磷酰胺組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，各劑量組與陰性對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系，故在本試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果為陽性。見表4。

劑量/[g/(kg·bw)]動物數(shù)/只觀察精子數(shù)/個香蕉/個精子畸形類型/個無鉤不定形其他精子畸形合計(jì)畸形數(shù)/個畸形率/%2．505500071860391242．48±0．37?5．0055000205783492094．18±0．85??10．00550003487109162464．92±0．96??陰性對照5500010144324911．82±0．19環(huán)磷酰胺55000106104130914318．62±0．98??

注：與陰性對照組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，**P<0．01。

3 討 論

急性毒性試驗(yàn)可在短時(shí)間內(nèi)觀察給予受試物后動物所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，為進(jìn)一步進(jìn)行毒性試驗(yàn)的劑量提供依據(jù)；遺傳毒性試驗(yàn)的組合應(yīng)考慮原核細(xì)胞與真核細(xì)胞、生殖細(xì)胞與體細(xì)胞、體內(nèi)與體外試驗(yàn)相結(jié)合的原則，對受試物的遺傳毒性以及是否具有潛在致癌作用進(jìn)行篩選。Ames試驗(yàn)廣泛應(yīng)用于檢測化學(xué)物的致突變性，是原核細(xì)胞基因突變試驗(yàn)的首選；微核與染色體損傷有關(guān)，測定骨髓PCE的微核發(fā)生率是檢測細(xì)胞遺傳損傷的一個非常有效的指標(biāo)；精子畸形試驗(yàn)?zāi)軌驒z測多種類型的化學(xué)物對生殖細(xì)胞的誘變作用[5]。本次我們對水芹進(jìn)行了急性毒性和遺傳毒性的研究，水芹的小鼠精子畸形試驗(yàn)各劑量組精子畸形率均顯著高于陰性對照組，且呈劑量-反應(yīng)關(guān)系，表明水芹可能對生殖細(xì)胞有誘變作用。

水芹的黃酮類物質(zhì)含量是旱芹的2倍[6]，其中芹菜素的含量也高于其他蔬菜[7]。國內(nèi)外學(xué)者對黃酮安全性的研究存在分歧，一方面黃酮類化合物被認(rèn)為具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性[8]；另一方面一些體外實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了某些黃酮類化合物具有毒副作用，包括遺傳毒性、致癌毒性、抗?fàn)I養(yǎng)效果等[9]。Rueff等[10]認(rèn)為黃酮類化合物在體內(nèi)的代謝可以部分解釋遺傳毒性和致癌性研究得出沖突結(jié)論的原因。芹菜素屬黃酮類化合物，有研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，芹菜素可致精子質(zhì)量及形態(tài)變化，對睪丸組織有一定的損傷作用[13]，提示具有遺傳毒性。故水芹致小鼠精子畸形率升高可能與芹菜素的作用有關(guān)，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。水芹資源在我國各地均有分布，尤以中東部和南方各省更為多見，是很多地區(qū)的傳統(tǒng)特色水生蔬菜，但本次實(shí)驗(yàn)研究表明，在未進(jìn)行綜合全面的安全性評價(jià)之前，不宜盲目大量開發(fā)采食野生水芹。

[1] 吳征鎰．新華本草綱要[M].上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1988：369.

[2] 李銀姬，樸惠善．水芹的研究進(jìn)展[J].延邊醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1996，19(4)：243-245.

[3] 黃凱豐，時(shí)政，歐騰，等．水芹的營養(yǎng)保健成分分析[J]．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(5)：434-435.

[4] 中華人民共和國衛(wèi)生部．保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范[S]．北京：衛(wèi)生部法制與監(jiān)督司編印，2003．

[5] 黃幸紓，陳星若．環(huán)境化學(xué)物致突變、致畸、致癌試驗(yàn)方法[M].杭州：浙江科學(xué)技術(shù)出版社，1985：3-13，218-265．

[6] 劉恒蔚，高夢祥，饒貴珍．野生水芹與早芹的營養(yǎng)成分比較分析[J]．中國野生植物資源，2007，26(1)：36-38．

[7] 劉淑萍，邸丁.不同種類蔬菜中黃酮類成分的含量分布[J]．河北聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2012，34(3)：112-114．

[8] 張華峰，王瑛，黃宏文．黃酮類化合物生物合成途徑的進(jìn)化及其在淫羊蒮中的研究展望[J]．中草藥，2006，37(11)：1745-1751．

[9] 汪何雅．黃酮類化合物的潛在毒性[J]．衛(wèi)生研究，2007，36(5)：640-642．

[10] Rueff J，Laires A，Borba H．Genetic toxicology of flavonoids：the role of metabolic conditions in the induction Of reverse mutation SOS functions and sister-chromatid exchanges[J]．Mutagenesis，1986，1(3)：179-183．

[11] 張曉晶．芹菜素對小鼠睪丸氧化還原平衡及功能的影響陽[D]．蘭州大學(xué)，2013，27-28．

[12] 吳雙，陳文材，劉玲飛，等．芹菜素對大鼠精子質(zhì)量及性激素的影響[J]．毒理學(xué)雜志，2014，28(5)：385-388．

[13] 寇詠梅，郭曉霞．芹菜素對生殖系統(tǒng)及內(nèi)分泌影響的研究進(jìn)展[J]．國際生殖健康/計(jì)劃生育雜志，2013，32(4)：305-308.

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2016-01-30)