鄒苑 陳浩 馬洪

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院頜面外科，貴州 貴陽 550004)

AURKA基因在口腔鱗癌中的表達(dá)及意義

鄒苑 陳浩 馬洪△

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院頜面外科，貴州 貴陽 550004)

目的 檢測極光激酶A(AURKA)基因在口腔鱗癌中的表達(dá)及意義。方法 收集20例口腔正常組織及42例口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)組織，采用Real-Time PCR檢測AURKA基因在不同口腔組織中的表達(dá)。結(jié)果 AURKA mRNA在OSCC中高表達(dá)，且不同分化程度，不同臨床分期，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。不同年齡，不同性別，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 AURKA在OSCC中高表達(dá)，AURKA作為激酶可能直接或間接地激活多種致癌蛋白或使多種抑癌蛋白失活，從而推動腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

極光激酶A； 口腔鱗癌； Real-Time PCR

極光激酶A(AURKA)基因編碼是一個定位于中心體上的絲氨酸蘇氨酸激酶，屬于激酶家族成員之一[1]。研究表明AURKA是一個周期性蛋白，在有絲分裂期后期開始定位于中心體，并且累積直到下一個周期的早期才被降解。通過參與中心體的復(fù)制、分離和成熟，在有絲分裂的細(xì)胞周期中起著重要作用。在紡錘體的兩極，其功能的正常發(fā)揮對細(xì)胞染色體準(zhǔn)確地平均分離到兩個子代細(xì)胞具有重要影響。AURKA的異常表達(dá)或功能缺陷往往導(dǎo)致染色體異倍性的產(chǎn)生，由此產(chǎn)生的基因組不穩(wěn)定性被認(rèn)為是腫瘤形成的重要原因之一。目前已知乳腺癌[2]等多種人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)其異常擴(kuò)增或高表達(dá)。但在口腔癌中的表達(dá)情況鮮有報道，本研究應(yīng)用Real Time PCR檢測AURKA在口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)中的表達(dá)情況，并比較其在不同臨床特征組中表達(dá)的差異，為OSCC的早期發(fā)現(xiàn)、早期診治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本及臨床資料 所有口腔鱗癌及正常組織標(biāo)本來自貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院頜面外科，收集時間2013年9月至2015年9月，包括口腔鱗狀細(xì)胞癌42例和正常組織20例，OSCC組織系頜面外科手術(shù)切取，正常組織來源于頜面外科拔牙患者的健康牙齦，所有OSCC均經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)病理科證實，所有標(biāo)本的獲得均經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)倫理學(xué)會審核通過。

1.2 實驗試劑 mRNA抽提試劑盒Dynabeads○RmRNA DIRECTTM、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit和PCR擴(kuò)增試劑 Light Cycler○R480 SYBR Green ⅠMaster 購自Roche公司。

1.3 引物合成 根據(jù)參考文獻(xiàn)[3]設(shè)計引物。AURKA 基因上游：cgccctgtaggatctgctt;下游：caaatatccccgcactctg。內(nèi)參引物POLR2A基因上游：gcaaattcaccaagagagac，下游：cacgtcgacaggaacatcag。引物由大連寶生物有限公司合成。

1.4 實驗設(shè)備 實驗專用純水機(jī)WP-UP-IV120(四川沃特爾)，高壓鍋(蘇泊爾)，4 ℃冰箱(海爾電器)，熱恒溫培養(yǎng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療機(jī)械廠)，各規(guī)格微量移液器(Eppendorf,德國)，超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備公司)，自動立式電熱蒸汽壓力滅菌器(上海博訊實業(yè)醫(yī)療設(shè)備有限公司)，壓力蒸汽滅菌器(開陽醫(yī)療器械廠，YXQ-SG46-28)，CFX connect Real Time System PCR儀(美國伯樂BIO-RAD公司)。

1.5 Real-Time PCR 利用磁珠法提取組織mRNA：從存儲在RNALATER試劑(-80 ℃)的組織中切取1 mm×2 mm大小組織，加入蛋白溶解酶K，55 ℃恒溫箱中消化。直到肉眼看不到任何組織，再加入40 μL Dynabeads dT25在搖床上搖晃10 min，立即放入磁珠中。移除上清液并用BufferA/B液順次洗滌。加入Tris-HCL，溶解磁珠并放入80 ℃恒溫箱2 min，再用于從磁珠中獲取mRNA。最后將收集來的大約13 μL mRNA(在Tris-HCL中的)直接加入事先準(zhǔn)備好的7.5 μL cDNA Synthesis Master Mis中。將樣品放入熱循環(huán)儀中，42 ℃中維持30 min，然后85 ℃維持5 min，最后4 ℃維持5 min。循環(huán)結(jié)束后便獲得逆轉(zhuǎn)錄來的cDNA，-20 ℃儲存?zhèn)溆?。將上述合成的cDNA上樣至10 μL反應(yīng)體系：SYBR Green ⅠMaster 5 μL，上下游引物 4.0 μL，模板1 μL。用CFX connect Real Time System PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃維持 1 min，變性95 ℃ 維持10 s，退火65 ℃ 維持30 s，共64個循環(huán)。每個樣品3個復(fù)孔，取CT平均值，采用相對定量法結(jié)果分析[4]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 10．0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，檢測結(jié)果結(jié)合臨床資料數(shù)據(jù)，P<0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

正常黏膜和OSCC組織中均檢測到AURKA mRNA的表達(dá)。AURKA mRNA在OSCC中的表達(dá)(0.38±0.21，n=42)明顯高于其在正常黏膜(0.38±0.21，n=20)中的表達(dá)，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(z=-2.153，P<0.05)。在各個臨床指標(biāo)的對比分析見表1。

表1 AURKA mRNA表達(dá)與口腔鱗癌臨床特征的相關(guān)性

3 討 論

AURKA基因編碼是一個進(jìn)化上保守的絲氨/蘇氨酸激酶，是Aurora激酶家族成員之一。在有絲分裂中，AURKA通過參與中心體的分離和成熟以及紡錘體兩極的建立，確保有絲分裂中染色體的正確分離和胞質(zhì)分裂的順利完成，在細(xì)胞周期中起著重要作用[5]。近年來的研究表明，AURKA可參與多條重要的細(xì)胞信號通路，作為激酶直接或間接地激活多種致癌蛋白或使多種抑癌蛋白失活，從而推動腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已有的研究表明，AURKA在異常情況下也是一個癌基因，且在多種人類腫瘤中均有報道存在AURKA的基因擴(kuò)增和過表達(dá)現(xiàn)象。AURKA高表達(dá)，在衰減p53[6]和p73[7]腫瘤抑制功能上起著重要作用。另有研究[8]表明AURKA的高表達(dá)通過上調(diào)抗調(diào)亡效應(yīng)因子NF-kB，在阻止癌細(xì)胞調(diào)亡中起著關(guān)鍵作用。然而AURKA參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子作用機(jī)制迄今尚不清楚。本研究證實AURKA在42例OSCC中呈高表達(dá)，且與OSCC臨床分期及分化程度有關(guān)，但其在OSCC發(fā)生發(fā)展中的分子作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

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Expression and significance of AURKA gene in oral squamous cell carcinoma

ZhouYuan,ChenHao,MaHong.

DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,AffiliatedOralMedicalHospital,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China.

Objective To detect the expression of Aurora kinase A (AURKA) gene in oral squamous cell carcinoma (OSCC). Methods 20 patients with oral normal tissue and 42 patients with OSCC were collected. Then the expression of AURKA gene was detected in different dental tissue by Real-Time PCR. Results The high expression of AURKA mRNA was detected in the OSCC tissue. There were statistical significantly differences between differentiation of different levels and different clinical stages, and no significant differences between different ages and different sexes. Conclusion The expression of AURKA is high in the OSCC. The AURKA may directly or indirectly activate multiple cancer proteins, or make a variety of inactivation of tumor suppressor proteins, and promote the development of cancer.

AURKA; Oral squamous cell carcinoma; Real-Time PCR.

貴州省國際合作計劃項目 [黔科合外G字(2014)7009號]

R739.8

A

1002-6975(2016)04-0358-02

2015-10-10)

△通信作者，E-mail：mahong1966@126.com