馬竹君 馮紅超 宋宇峰 高瓊 孫昊軒

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550004;2.貴陽(yáng)市口腔醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550001;3.貴州省食品藥品監(jiān)督管理局，貴州 貴陽(yáng) 550004;4.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院頜面外科，貴州 貴陽(yáng) 550004;5.河北省眼科醫(yī)院口腔頜面外科，河北 邢臺(tái) 054001)

GSK-3β、E-cadherin、Cytokeratin在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

馬竹君1馮紅超2△宋宇峰3高瓊4孫昊軒5

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550004;2.貴陽(yáng)市口腔醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550001;3.貴州省食品藥品監(jiān)督管理局，貴州 貴陽(yáng) 550004;4.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院頜面外科，貴州 貴陽(yáng) 550004;5.河北省眼科醫(yī)院口腔頜面外科，河北 邢臺(tái) 054001)

目的 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察已確診的口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中上皮間質(zhì)化(EMT)相關(guān)蛋白及糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的表達(dá)，初步探討其在人口腔鱗狀細(xì)胞癌中的臨床意義，并研究其在口腔鱗癌及正常上皮組織中上皮間質(zhì)化中的作用，為口腔鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)防、控制和治療提供一定參考。方法 通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)32例口腔鱗癌組織中上皮源性標(biāo)記物：上皮-鈣黏蛋白(E-cad)及細(xì)胞角蛋白(CK)、GSK-3β的表達(dá)情況，并與臨床病理資料作對(duì)照分析。結(jié)果 在口腔鱗癌組中，GSK-3β、CK及E-cad的表達(dá)明顯低于正常組織組(P<0.05)；T4+T3組中，E-cad、GSK-3β的表達(dá)明顯低于T1+T2組(P<0.05)；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，E-cad、CK及GSK-3β的表達(dá)低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)，E-cad與GSK-3β表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.572，P=0.001)。結(jié)論 口腔鱗癌組織中存在上皮間質(zhì)化現(xiàn)象，E-cad、CK表達(dá)減少，GSK-3β在OSCC與正常上皮組織表達(dá)中存在差異，GSK-3β的減少可促進(jìn)OSCC細(xì)胞發(fā)生EMT，使口腔鱗癌侵襲及轉(zhuǎn)移，聯(lián)合上述3個(gè)因子，可能為預(yù)測(cè)OSCC的轉(zhuǎn)移及針對(duì)OSCC轉(zhuǎn)移的治療研究提供一定幫助。

口腔鱗癌; 糖原合成酶激酶-3β; 細(xì)胞角蛋白; 上皮-鈣黏蛋白; 上皮間質(zhì)化; 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)是口腔頜面部最常見(jiàn)的上皮來(lái)源的惡性腫瘤，約占口腔頜面部腫瘤的80%，具有惡性程度高，易向周圍侵襲,淋巴結(jié)易轉(zhuǎn)移，預(yù)后差等特點(diǎn)，發(fā)病率逐年上升。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的生物學(xué)特性之一[1]，其中OSCC的頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是目前臨床上腫瘤致死的主要因素，嚴(yán)重威脅人類的生命及健康。上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指上皮細(xì)胞失去上皮表型轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞表型的過(guò)程，是一個(gè)繁雜有序的、多基因的、可調(diào)控的生物學(xué)過(guò)程，在發(fā)育、組織愈合及器官纖維化等過(guò)程中起關(guān)鍵作用。其特點(diǎn)是上皮細(xì)胞標(biāo)記物如上皮-鈣黏蛋白(E-cad)、細(xì)胞角蛋白(CK)的丟失與間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物的獲得[2]。隨著研究深入，有研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生了轉(zhuǎn)移的胸腺導(dǎo)管癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等惡性腫瘤中，存在EMT現(xiàn)象，與多條信號(hào)通路相關(guān)[5]，EMT與腫瘤的遷移及侵襲逐漸成為近年來(lái)研究熱點(diǎn)。

有研究表明，糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)與食道癌、喉癌等許多惡性腫瘤密切相關(guān)，而對(duì)于GSK-3β及其相關(guān)信號(hào)通路與OSCC的臨床關(guān)系及其與OSCC中EMT的關(guān)系的相關(guān)研究較少。為了闡明GSK-3β與OSCC的臨床關(guān)系與OSCC中是否存在EMT而導(dǎo)致其易轉(zhuǎn)移的惡性生物學(xué)行為及其機(jī)制，我們通過(guò)免疫組化(PV二步法)的方法對(duì)32例口腔鱗癌標(biāo)本中GSK-3β的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，同時(shí)以免疫組化的方法對(duì)EMT標(biāo)記蛋白：E-cad、CK進(jìn)行了檢測(cè)分析，為了解口腔鱗癌轉(zhuǎn)移的發(fā)展機(jī)制提供一定理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本選擇 收集貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔頜面外科2009-2015年手術(shù)切除的，術(shù)前未采用任何針對(duì)腫瘤的治療，如放療、化療等，經(jīng)組織蠟塊保存完好的口腔鱗癌標(biāo)本。均經(jīng)常規(guī)病理檢查確診為鱗狀細(xì)胞癌。

1.1.2 臨床資料 口腔鱗癌患者32例，男23例，女9例，年齡42～78歲，平均60歲。高分化21例、中低分化11例。無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移13例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例，無(wú)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者。另設(shè)12例口腔黏膜正常組織作對(duì)照。

1.1.3 試劑 小鼠抗人細(xì)胞角蛋白(廣譜)、E-cadherin單克隆抗體及DAB顯色試劑盒、免疫組化PV試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，小鼠抗人GSK-3β單克隆抗體購(gòu)自恩晶生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色行PV二步法 組織蠟塊經(jīng)厚5 μm連續(xù)切片，脫蠟水化后，檸檬酸抗原修復(fù)液高壓熱處理修復(fù)抗原，3%去離子水封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶分別加入GSK-3β(1∶50)、E-cadherin(1∶100)、細(xì)胞角蛋白(1∶100)一抗工作液、4 ℃孵育過(guò)夜。加入生物素化二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封固。PBS代替一抗做陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)程序嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。另取一張切片行蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.2.2 結(jié)果判定 免疫組織化學(xué)及原位雜交每例切片隨機(jī)選擇10個(gè)視野(放大200倍)拍照。參考相關(guān)文獻(xiàn)以Imagepro-plus圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行平均光密度(MOD)分析，分析中進(jìn)行了光密度校準(zhǔn)及空間標(biāo)定，按照陽(yáng)性表達(dá)在照片中的范圍在照片中畫出測(cè)量區(qū)域，即總面積，讀取積分光密度(IOD)數(shù)值，作為此張照片的累積光密度值。MOD計(jì)算方法為MOD=IOD/Area(Sum)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，GSK-3β、E-cad、CK光密度不滿足正態(tài)分布，參數(shù)檢驗(yàn)(P>0.05)，故采用中位數(shù)及四分位間距M(P25，P75)表示。正常組織與口腔鱗癌組織的光密度的差異，不同臨床特征下GSK-3β、E-cad、CK光密度比較采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)，兩樣本比較采用Spearman秩和相關(guān)進(jìn)行相關(guān)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GSK-3β、E-cad、CK在OSCC及正常組織中的表達(dá)

E-cad陽(yáng)性信號(hào)主要位于正常上皮組織細(xì)胞膜，少量表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)(圖1a)，在OSCC組織中多表達(dá)于仍存在細(xì)胞極性的鱗狀上皮部分，呈淺淡的不均質(zhì)點(diǎn)狀分布，在大多數(shù)癌巢組織無(wú)著色表現(xiàn)(圖1b)；CK主要定位于上皮細(xì)胞質(zhì)(圖1c)，相較于周圍上皮組織，癌巢部位CK的表達(dá)相對(duì)較低(圖1d)。GSK-3β的陽(yáng)性信號(hào)主要定位于正?？谇击[狀上皮細(xì)胞質(zhì)中(圖1e)，在OSCC組織中表達(dá)減少或少數(shù)在細(xì)胞核中異位表達(dá) (圖1f)。

圖1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(SP×20)

2.2 GSK-3β、E-cad、CK在OSCC與正常組織表達(dá)的MOD值

GSK-3β、E-cad、CK在OSCC與正常組織表達(dá)的MOD值見(jiàn)表1，在OSCC組織中，GSK-3β、E-cad及CK的表達(dá)明顯低于正常組織(P<0.05)。

表1 GSK-3β、E-cad、CK在OSCC與正常組織表達(dá)的MOD值

2.3 OSCC組織中GSK-3β、E-cad、CK表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系

在OSCC中，E-cad在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，在T1+T2分期中表達(dá)低于T3+T4分期；CK在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；GSK-3β在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中表達(dá)低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，在T1+T2分期中表達(dá)高于T3+T4分期，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；GSK-3β、E-cad表達(dá)在不同分化組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CK的表達(dá)在不同腫瘤分期中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 OSCC組織中GSK-3β、E-cad、CK表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系

2.4 OSCC中GSK-3β、E-cad、CK的相關(guān)性

CK與其他指標(biāo)無(wú)相關(guān)性，E-cad及GSK-3β呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.572(P=0.001)。

3 討 論

GSK-3β是一種能磷酸化多種底物的多功能絲氨酸/蘇氨酸激酶[6]。它可與其他蛋白組成復(fù)合物，也可游離散在分布于胞漿中，在成熟的上皮細(xì)胞中為活化狀態(tài)，通過(guò)對(duì)底物磷酸化[7]，可作用于眾多信號(hào)蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖、存活和凋亡[8-9]。GSK-3β在多種信號(hào)通路中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用[10-11]，此外研究[12]還發(fā)現(xiàn)，在口腔、肝、前列腺等腫瘤中，GSK-3β具有抑瘤作用，而Chandra等[13]發(fā)現(xiàn)，在已發(fā)生EMT的侵襲性胸腺導(dǎo)管癌中，GSK-3β在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)減少，細(xì)胞核中有表達(dá)，證實(shí)GSK-3β與腫瘤的EMT存在一定關(guān)系。E-cad是一類介導(dǎo)同型細(xì)胞間黏附的鈣依賴型跨膜糖蛋白，是目前公認(rèn)的最為經(jīng)典的上皮細(xì)胞標(biāo)記物[14]，主要參與細(xì)胞間連接，維持生理?xiàng)l件下上皮組織的極性和結(jié)構(gòu)的完整性[10]。有研究[15-17]認(rèn)為，在甲狀腺腫瘤、胃癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中發(fā)現(xiàn)E-cad的表達(dá)下調(diào)，E-cad的減少或丟失是EMT發(fā)生的典型特征，與上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞侵襲有密切聯(lián)系[18]。CK是另一種上皮細(xì)胞特征標(biāo)記物，其具有多個(gè)亞型且不同亞型存在于不同類型上皮細(xì)胞的不同階段[19]，已有研究表明在某些人上皮腫瘤中有不同類型的CK的表達(dá)。E-cad、CK是目前最常用的監(jiān)測(cè)EMT進(jìn)程的上皮標(biāo)記物。

本研究結(jié)果顯示，GSK-3β、E-cad、CK在OSCC組織中表達(dá)較正常組織低(P<0.05)，這與多數(shù)研究結(jié)果相似，提示GSK-3β、E-cad、CK的異常表達(dá)可能與OSCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)，OSCC可能存在EMT現(xiàn)象；E-cad、GSK-3β在T1+T2分期組表達(dá)較T3+T4分期組高，提示異常的GSK-3β低表達(dá)，可能促進(jìn)OSCC生長(zhǎng)，瘤細(xì)胞不易凋亡，腫瘤能順利增殖、分化，E-cad的異常低表達(dá)，促使瘤組織細(xì)胞間連接越加松散；E-cad、GSK-3β、CK在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達(dá)較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組降低，提示E-cad、CK、GSK-3β異常表達(dá)與OSCC的淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，三者表達(dá)的降低有可能使OSCC發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的幾率提高。本研究結(jié)果顯示，上皮標(biāo)記物E-cad及CK存在異常低表達(dá)，在OSCC組織可能存在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，E-cad與GSK-3β表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.572，P=0.001)，提示GSK-3β的異常低表達(dá)可能是OSCC中發(fā)生EMT的重要因素，與腫瘤EMT發(fā)生密切相關(guān)。

有研究[12]表明，GSK-3β在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)減少，對(duì)腫瘤的抑瘤作用降低，可以使腫瘤的發(fā)生發(fā)展獲得一定自由，同時(shí)GSK-3β可參與Wnt/β-catenin、FAS等多種與EMT發(fā)生機(jī)制相關(guān)的信號(hào)通路，起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，其表達(dá)減少，有可能促進(jìn)腫瘤發(fā)生EMT現(xiàn)象[20]，使細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移和入侵的能力。OSCC的淋巴轉(zhuǎn)移及侵襲機(jī)制涉及多因素及機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究E-cad、CK、GSK-3β在OSCC中的表達(dá)，證實(shí)在人OSCC中存在EMT現(xiàn)象，通過(guò)分析各因子與臨床病理資料之間關(guān)系證實(shí)，OSCC中GSK-3β的表達(dá)水平與OSCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)，且GSK-3β與EMT發(fā)生有一定關(guān)系，其具體如何參與EMT的進(jìn)程，有待進(jìn)一步深入研究。GSK-3β的抑瘤及對(duì)EMT形成的影響使其有可能成為早期預(yù)測(cè)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的標(biāo)記蛋白，為提前預(yù)測(cè)腫瘤的轉(zhuǎn)移提供新的預(yù)測(cè)方法及為研究腫瘤的治療方法提供一些新的思路。

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Expression and significance of GSK-3β etc. and relation with epithelial-mesenchymal transition inoral squamous cell carcinoma

MaZhujun1,FengHongchao2,SongYufeng3,GaoQiong4,SunHaoxuan5.

1.GuizhouMedicialUniversity,Guiyang550004,China. 2.GuiyangCityStomatologicalHospital.Guiyang550001,China. 3.FoodandDrugAdministrationBureauinGuizhouProvince,Guiyang550004,China. 4.DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery.AffiliatedStomatologyHospital,GuizhouMedicialUniversity,Guiyang550004,China. 5.DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,OphthalmologyHospitalofHebeiProvince,Xingtai054001,China.

Objective To analysis the expression of GSK-3β and EMT correlated protein to discuss the clinicopathological feature of OSCC and investigate the relationship between EMT and OSCC lymph node invasion or distant metastasis. Methods 32 cases of OSCC and 10 cases of normal human were detected by IHC to explore the expression of GSK-3β and epithelial drived markers: E-cadherin, Cytokeratin. Results In OSCC group, the expression of GSK-3β, Cytokeratin and E-cadherin is significantly lower than those in the normal group (P<0.05, Table 1); the expression of GSK-3β and E-cadherinis in T4+T3 group is significantly lower than T1+T2 group (P<0.05, Table 2). In the group with lymph node metastasis, the expression of GSK-3β, E-cadherin and Cytokeratin is obviously lower than the group without lymph node metastasis (P<0.05,). The expression of GSK-3β, E-cadherin and Cytokeratin had no obvious relationship with patient's degree of tumor differentiation (P>0.05). The expression of GSK-3β and E-cadherin were observed strong positive correlations (r=0.572,P=0.001). Conclusion EMT takes place in OSCC. E-cadherin, Cytokeratin and GSK-3βare differently expressed in OSCC and normal epithelial tissue. GSK-3β may involve the progression of EMT in OSCC, promote infiltraton and metastasis of OSCC. Combined with the above three factors, it may be helpful for predicting the transfer of OSCC and the targeted therapy of OSCC.

OSCC; GSK-3β; Cytokeratin; E-cad; EMT; LNM

貴陽(yáng)市衛(wèi)生局科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目 (2014筑衛(wèi)科技合同字第15號(hào));貴州省科技計(jì)劃課題任務(wù)[黔科合LG字(2011)001號(hào)]

R739.8

A

1000-744X(2016)04-0354-04

2015-09-25)

△通信作者，E-mail：hongchaof@126.com