龔啟華 楊一峰 趙天力 陳金蘭 李業(yè)濤

(1.貴州省人民醫(yī)院心臟外科,貴州 貴陽 550002；2.中南大學湘雅二院胸心外科,湖南 長沙 410011 )

22q11.2微缺失在貴州少數(shù)民族先天性心臟病患者中的研究

龔啟華1楊一峰2趙天力2陳金蘭2李業(yè)濤1

(1.貴州省人民醫(yī)院心臟外科,貴州 貴陽 550002；2.中南大學湘雅二院胸心外科,湖南 長沙 410011 )

目的 探索22q11.2微缺失在貴州少數(shù)民族先天性心臟病患者中的發(fā)病情況。方法 選取44例苗族、侗族及布依族先天性心臟病患者，在UCSC數(shù)據(jù)庫中選擇合適的BAC克隆，自制雙色BAC探針，采用雙色細菌人工染色體-熒光原位雜交技術(shù)對上述患者進行22q11.2微缺失檢測。結(jié)果 在2例法洛四聯(lián)癥患者中檢測到22q11.2微缺失，缺失率為4.5%(2/44)。結(jié)論 在苗族、布依族、侗族等少數(shù)民族先天性心臟病患者中存在22q11.2微缺失現(xiàn)象，對發(fā)現(xiàn)的陽性患者應(yīng)密切觀察其行為和認知方面的發(fā)育情況，一旦發(fā)現(xiàn)異常，應(yīng)予以積極干預(yù)。

少數(shù)民族； 雙色細菌人工染色體-熒光原位雜交； 22q11.2微缺失； 先天性心臟病

22q11.2微缺失綜合征是人類最常見的微缺失綜合征，約80%的22q11.2微缺失患者合并某種類型的先天性心臟畸形[1-3]。絕大部分22q11.2微缺失綜合征患兒存在學習困難、智力障礙程度不等的認知缺陷[4-5]，該微缺失綜合征患者患精神分裂癥的風險較普通人群明顯增加。全國苗族、布依族、侗族人口主要分布在貴州，目前國內(nèi)外鮮有關(guān)于22q11.2微缺失在苗族、布依族、侗族等少數(shù)民族中發(fā)病情況的研究。因此，有必要對苗族、布依族、侗族等少數(shù)民族先天性心臟病患者22q11.2微缺失發(fā)病情況進行研究，以期從分子水平闡明先天性心臟病的發(fā)病機理；同時對發(fā)現(xiàn)的陽性患者在行為和認知方面給予科學的指導(dǎo)和建議,以提高該類患者的生活質(zhì)量和社會適應(yīng)能力。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇貴州省人民醫(yī)院心臟外科收治的44例苗族、侗族及布依族先天性心臟病患者，所有患者均經(jīng)心臟彩色多普勒及手術(shù)確診。其中男22例，女22例；年齡7個月至53歲，平均(11.9±10.8)歲；苗族16例，侗族10例，布依族18例；所合并先天性心臟病包括：室間隔缺損16例，室間隔缺損合并房間隔缺損3例，室間隔缺損合并動脈導(dǎo)管未閉1例，室間隔缺損合并肺動脈瓣狹窄1例，室間隔缺損、主動脈瓣脫垂并返流1例，肺動脈瓣狹窄1例，房間隔缺損7例，動脈導(dǎo)管未閉2例，法洛四聯(lián)癥5例，部分型肺靜脈異位引流3例，主動脈竇瘤破裂、室間隔缺損并主動脈瓣返流1例，先天性主動脈瓣狹窄1例，先天性主動脈瓣狹窄并關(guān)閉不全1例，Ebstein畸形合并房間隔缺損1例。

1.2 方法

1.2.1 選擇BAC克隆 在UCSC數(shù)據(jù)庫中根據(jù)實驗需要選擇了2個BAC克隆，其中1個為經(jīng)典缺失區(qū)域遠側(cè)克隆，另1個為位于缺失區(qū)域中克隆，分別標記不同的熒光顏色，所選BAC克隆及標記情況見表1。

表1 所選BAC克隆及標記情況

1.2.2 制片 將肝素抗凝的患者外周血接種于外周血淋巴細胞培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)懸浮培養(yǎng)72 h后進行收獲。調(diào)定細胞懸液濃度，用100 μL移液器吸10 μL滴片,稍干,將玻片依次放入70%、90%、100%乙醇中各2 min，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 制備探針 無菌操作臺上，接種BAC菌種于含氯霉素(氯霉素終濃度為30 μg/mL)的固體LB平板中，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。從平板中挑取單個細菌克隆轉(zhuǎn)入含氯霉素(氯霉素終濃度為30 μg/mL)的5 mL液體LB培養(yǎng)液中，空氣搖床上37 ℃，300 rpm，振蕩培養(yǎng)12～16 h。DNA的分離提純采用QIAGEN公司的QIAGEN Large-Construct Kit抽提，具體操作按說明書進行。提純后用核酸測定儀測定所獲BAC-DNA的濃度(200～500 ng為宜)，采用缺口平移標記法標記探針(Nick Translation kit，vysis 公司)。取標記好的探針5 μL,運用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，探針片段在200～500 bp為宜。取標記好的探針45 μL，加入1 μL E．coli tRNA(5 μg/μL)、5 μL鮭魚精DNA(10 mg/mL)、6 μL 8M醋酸胺、1 μL糖元 (10 mg/mL)及200 μL無水乙醇，-70℃放置30 min，4 ℃ 15 000 rpm離心10 min，去上清，加入200 μL 70%乙醇，4 ℃ 15 000 rpm離心5 min，吸去乙醇，加入甲酰胺15 μL，室溫避光溶解20 min后-20 ℃保存。

1.2.4 熒光原位雜交 取7.5 μL已變性好的雜交液滴置已變性干燥的玻片雜交區(qū)，封片后置密閉濕盒中37 ℃雜交48 h。從培養(yǎng)箱中取出玻片，去除封片膠。將玻片置于已預(yù)溫至43 ℃的50% Formamide /2×SSC洗滌15 min、50% Formamide /2×SSC洗滌15 min、2×SSC洗滌5 min、1×SSC洗滌5 min、0.1%Triton X-100/4×SSC洗滌5 min、4×SSC 洗滌5 min、4×SSC洗滌5 min及2×SSC洗滌5 min，室溫下依次過70%、90%及100%乙醇各2 min，室溫下干燥后加DAPI 15 μL染色、蓋上蓋玻片。

1.2.5 觀察記錄結(jié)果 采用Leica DM5000B熒光顯微鏡對雜交片子進行觀察，并對雜交結(jié)果進行拍照保存。

2 結(jié) 果

44例患者中在2例法洛四聯(lián)癥患者檢測到22q11.2微缺失，總?cè)笔z出率為4.5%。見圖1。其余患者中未檢測到22q11.2微缺失存在。

注：綠色信號代表對照組探針，紅色信號代表實驗組探針。探針組合：CTD-2335H16(綠色)+RP11-316L10(紅色)；兩圖中綠色信號為2個，紅色信號均為1個，表示該2例患者均存在22q11.2微缺失。 圖1 a、b分別為2例22q11.2微缺失檢測陽性患者FISH檢查結(jié)果。

3 討 論

22q11.2微缺失綜合征臨床表現(xiàn)變異較大，包括心臟畸形、特殊面容、認知缺陷、精神疾病、行為異常、免疫缺陷、腭裂、甲狀旁腺缺如或發(fā)育不良等[6-12]。22q11.2微缺失綜合征被認為是除21-三體綜合征以外的引起先天性心臟畸形最常見的遺傳因素，其所合并的先天性心臟畸形是導(dǎo)致22q11.2微缺失綜合征患者早期死亡的主要原因，往往需要進行外科手術(shù)矯治。

在以往研究中先天性心臟病患者22q11.2微缺失綜合征的發(fā)病率差異較大。Agergaard 等[13]認為22q11.2微缺失綜合征在先天性心臟病患者中的發(fā)病情況與研究人群所患心臟畸形種類、年齡范圍及是否合并心外畸形等納入標準密切相關(guān)。在主動脈弓中斷、永存動脈干、肺動脈閉鎖合并室間隔缺損以及法洛四聯(lián)癥4種圓錐動脈干畸形中，22q11.2微缺失綜合征具有較高的發(fā)病率。但在房間隔缺損、室間隔缺損、左心發(fā)育不良綜合征及心室雙入口等非圓錐動脈干畸形中也存在合并22q11.2微缺失綜合征的報道，病理機制尚不明確[13-14]。在本組研究中，共在2例法洛四聯(lián)癥患者中發(fā)現(xiàn)存在22q11.2微缺失，發(fā)病率為4.5%(2/44),明顯低于上述研究;且在房間隔缺損、室間隔缺損等非圓錐動脈干畸形中未發(fā)現(xiàn)合并22q11.2微缺失。導(dǎo)致上述差異出現(xiàn)的原因考慮與以下因素有關(guān)：(1)由于本心臟中心所處地區(qū)的經(jīng)濟社會原因，大部分較復(fù)雜的圓錐動脈干畸形患者未能就診接受手術(shù)治療，使本組研究中圓錐動脈干畸形患者病例數(shù)比例較上述研究偏低。(2)本組研究對象總樣本量偏小。在今后的研究中我們將擴大樣本量及所納入心臟畸形的范圍，更加準確地反映22q11.2微缺失綜合征在苗族、布依族、侗族等少數(shù)民族先天性心臟病患者中的發(fā)病情況。

絕大部分22q11.2微缺失綜合征患兒存在學習困難、智力障礙程度不等的認知缺陷[4-5]。22q11.2微缺失綜合征還與行為及精神異常密切相關(guān)，該類患者患精神分裂癥的風險較普通人群明顯增加。研究[15-16]發(fā)現(xiàn), 大約22.6%～25%的22q11.2微缺失綜合征患兒在青少年期或成人期發(fā)展為精神分裂癥。本研究中，1例學齡患兒存在語言發(fā)育遲緩，已向患者家屬推薦進行干預(yù)治療。由于本組研究對象年齡偏小、隨訪時間偏短，暫未發(fā)現(xiàn)精神異常情況的發(fā)生，但隨著患兒的成長及隨訪時間的延長，有可能將面臨這一問題。我們已對接受隨訪的患兒家屬進行宣教，以期早期發(fā)現(xiàn)患兒成長過程中的精神異常情況，并及時予以治療。

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Study on 22q11.2 microdeletion in patients with congenital heart disease in the minority in Guizhou province.

GongQihua1,YangYifeng2,ZhaoTianli2,ChenJinlan2,LiYetao1.

1.DepartmentofCardiacSurgery,theGuizhouProvincialpeople'sHospital, 550002,P.R.China. 2.DepartmentofThoracicandCardiovascularSurgery,SecondXiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410011,China.

Objective To determine the frequency of 22qll.2 microdeletions in patients with congenital heart disease in the Miao, Dong and Buyi minorities in Guizhou province. Methods A total of 44 patients with congenital heart disease，22 female and 22 male , ranging in age from 0.58 to 53 years, were included in our study. The dural-color bacterial artificial chromosome (BAC) fluorescence in situ hybridization with RP11-316L10/CTD-2335H16 probe was used to find the chromosome 22qll.2 deletion in peripheral blood cells of patients.Results Chromosome 22qll.2 microdeletion was detected in 2(2/44) patients with tetralogy of fallot. The total frequency of 22qll.2 deletion was 4.5%. Conclusion There is 22qll.2 microdeletion in Miao, Dong and Buyi minorities.

Minority； Dural-color bacterial artificial chromosome fluorescence in situ hybridization； 22q11.2 microdeletion； Congenital heart disease

貴州省科學技術(shù)基金[黔科合J字(2009)2317]

R654.2

A

1002-6975(2016)04-0351-03

2015-09-12)