殷杰 陳蓉 肖東凡

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州省人民醫(yī)院新生兒科，貴州 貴陽(yáng) 550002)

MMP-2在缺氧缺血性腦損傷新生大鼠海馬中的表達(dá)及意義

殷杰1，2陳蓉2△肖東凡1，2

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州省人民醫(yī)院新生兒科，貴州 貴陽(yáng) 550002)

目的 探討在缺氧缺血性腦損傷(HIBD)新生大鼠海馬中基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的表達(dá)及其作用。方法 將7 d齡新生SD大鼠42只隨機(jī)分為假手術(shù)組及HIBD模型組，后者根據(jù)處死時(shí)間分為 6 h、12 h、24 h、48 h、3 d、7 d組(n=6)，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組大鼠海馬中MMP-2的表達(dá)水平。結(jié)果 MMP-2蛋白表達(dá)量在HIBD后呈逐漸增高趨勢(shì)，在24 h至3 d時(shí)間段增長(zhǎng)趨勢(shì)平緩，到7 d時(shí)顯著增高達(dá)高峰；與假手術(shù)組比較，24 h組、48 h組、3 d組、7 d組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 MMP-2在新生大鼠HIBD后各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)有不同程度的變化，可能參與了HIBD的發(fā)生發(fā)展。

基質(zhì)金屬蛋白酶-2； 缺氧缺血性腦損傷； 新生大鼠； 海馬

新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)是圍產(chǎn)期窒息缺氧引起新生兒死亡及神經(jīng)發(fā)育障礙的原因之一，目前仍無(wú)較好的預(yù)防及治療措施。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中血腦屏障的破壞及通透性改變導(dǎo)致腦水腫是早期發(fā)生的主要病理過(guò)程和損害因素?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一組Zn2+依賴的蛋白水解酶，主要參與細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的降解和重塑[1]。其中MMP-2是MMPs基因家族中的一個(gè)重要成員,對(duì)腦損傷后血腦屏障的破壞發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[2]，但最近研究[3-4]表明MMP-2還可能參與了神經(jīng)損傷的修復(fù)，故目前關(guān)于MMPs在缺氧缺血性腦損傷(HIBD)后腦組織中的表達(dá)研究觀點(diǎn)不一，其作用尚未完全明確。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察 HIBD 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中MMP-2在海馬的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化，以探討其在 HIBD病程中的作用及意義，為臨床治療HIE提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康7 d齡SD大鼠(清潔級(jí)，母鼠帶養(yǎng))42只，雌雄不限，體質(zhì)量8～15 g(購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，批號(hào): ISCXK(黔) 2012-001。隨機(jī)分成假手術(shù)組(n=6)、HIBD模型組(n=36)，根據(jù)處死時(shí)間點(diǎn)HIBD組又分6個(gè)亞組：6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d，每個(gè)亞組6只。

1.1.2 主要試劑及儀器 兔抗鼠MMP-2單克隆抗體(美國(guó)abcam，ab86607)；山羊抗鼠一步法免疫組化聚合物檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋，PV-6002)；4%多聚甲醛(武漢博士德，AR1068)；600數(shù)顯三用恒溫水浴箱(金壇市友聯(lián)儀器研究所)；密閉缺氧艙(上海新華醫(yī)院研究所)；8%O2+92%N2混合氣體(貴陽(yáng)申建氣體公司)；倒置顯微鏡(日本Nikon TE-2000)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制備 根據(jù)改良Rice法，大鼠乙醚吸入麻醉后，將其仰臥固定于操作板上，常規(guī)消毒切開(kāi)頸部皮膚,分離并結(jié)扎左頸總動(dòng)脈, 縫合切口,待大鼠清醒后置于37 ℃恒溫水浴密閉缺氧艙中，以2 L/min流量向艙內(nèi)通入8%O2+92%N2混合氣體，2 h后恢復(fù)正常供氧并將大鼠送回母鼠身邊喂養(yǎng)。假手術(shù)組僅切開(kāi)頸部皮膚, 分離左頸總動(dòng)脈后不予結(jié)扎, 縫合切口后不做低氧處理。

1.2.2 標(biāo)本與切片制備 將各組大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉后，開(kāi)胸暴露心臟，自心尖進(jìn)針向左心室內(nèi)灌注無(wú)菌生理鹽水，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，至流出液體清亮，肝臟及肺臟變白后，繼續(xù)灌注4%多聚甲醛至大鼠僵硬后，斷頭取全腦組織置于4%多聚甲醛中室溫固定72 h以上。取固定好的腦組織，從視交叉及其后5 mm處行冠狀切面(包括海馬區(qū))，經(jīng)過(guò)脫水、石蠟包埋后，切片(4 μm)，貼片于防脫載玻片上，60 ℃烤片2 h備用。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 切片常規(guī)脫蠟至水，120 ℃乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復(fù)液修復(fù)2 min；3%H2O2孵育浸泡10 min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；PBS沖洗3 min×3次,滴加一抗(MMP-2，1∶100)，濕盒中4 ℃過(guò)夜，PBS沖洗3 min×3次；滴加聚合物檢測(cè)試劑，37 ℃孵育15 min，PBS沖洗2 min×3次；滴加DAB顯色試劑顯色，顯微鏡下觀察顯色，自來(lái)水適時(shí)終止，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水返藍(lán)；脫水、透明后封片。以細(xì)胞漿著色為黃色或棕黃色判定為MMP-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)，高倍鏡下在海馬區(qū)隨機(jī)取5個(gè)視野采圖，利用Image pro plus6.0圖像分析軟件測(cè)定積分光密度值(IOD)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

各組海馬區(qū)MMP-2 蛋白表達(dá)見(jiàn)圖1，假手術(shù)組海馬區(qū)可見(jiàn)MMP-2有少量陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)(圖1a)，HIBD各組海馬區(qū)MMP-2蛋白表達(dá)于缺氧缺血后呈逐漸增加趨勢(shì)，但在24 h至3 d時(shí)間段增長(zhǎng)趨勢(shì)平緩(圖2)，到7 d時(shí)胞漿染色最深(圖1g)，蛋白表達(dá)至高峰(圖2)。與假手術(shù)組比較，HIBD模型組24 h、48 h、3 d、7 d MMP-2蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)MMP-2蛋白表達(dá)(×400)

圖2 各組MMP-2積分光密度值(IOD)趨勢(shì)

組別nMMP2假手術(shù)組698．8±23．3HIBD6h組6109．5±28．3HIBD12h組6127．5±9．1HIBD24h組6135．6±20．2?HIBD48h組6138．5±15．5?HIBD3d組6156．4±25．1?HIBD7d組6206．7±20．8?#

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與HIBD模型組前一時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05。

3 討 論

MMPs是一類鋅依賴性蛋白水解酶家族，研究[5]表明，該家族中MMP-2對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)分子的降解及其對(duì)血腦屏障的破壞與腦損傷密切相關(guān)。MMP-2即明膠酶A，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要由神經(jīng)元、腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等合成和分泌，其作用底物包括膠原蛋白、彈性蛋白、蛋白多糖和纖維連接蛋白等[6]。Rosenberg等[7]早期發(fā)現(xiàn)在大鼠腦內(nèi)注射MMP-2可促使血腦屏障開(kāi)放，因其可降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分如Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白和腦血管基底膜，導(dǎo)致血管源性腦水腫，故現(xiàn)將MMPs作為腦損傷嚴(yán)重程度的標(biāo)志。通過(guò)應(yīng)用MMPs抑制劑及類似物來(lái)抑制MMPs表達(dá)從而發(fā)揮對(duì)血腦屏障保護(hù)作用的研究已成為熱點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示HIBD后MMP-2在海馬區(qū)蛋白表達(dá)呈逐漸增高趨勢(shì)，從24 h開(kāi)始與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在24 h至3 d期間增長(zhǎng)趨勢(shì)緩慢，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3 d后顯著增高,到7 d時(shí)達(dá)高峰，與陳大慶等[8]研究基本一致。說(shuō)明缺氧缺血刺激可誘導(dǎo)MMP-2表達(dá)增加，其可能參與HIBD后血腦屏障的破壞，但可能并非是導(dǎo)致HIBD后腦水腫的主要因子。一般認(rèn)為，HIBD后血腦屏障的破壞及通透性增高造成的腦水腫于24～48 h達(dá)高峰。本實(shí)驗(yàn)中HIBD后MMP-2表達(dá)高峰出現(xiàn)較晚，與腦水腫高峰時(shí)間不符。而近年多數(shù)研究提示，MMP-2與神經(jīng)修復(fù)有著密切關(guān)系。Szepesi等[3]及Cossanzo等[4]研究表明，MMP-2可促進(jìn)神經(jīng)損傷后突觸的結(jié)構(gòu)重建及再生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HIBD后MMP-2表達(dá)于7 d時(shí)達(dá)高峰，與血管生成及神經(jīng)膠質(zhì)增生出現(xiàn)的時(shí)間基本平行，提示MMP-2在HIBD恢復(fù)階段可能發(fā)揮修復(fù)作用。馬躍文等[9]對(duì)大鼠進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練，發(fā)現(xiàn)7 d及14 d時(shí)缺血再灌注腦損傷組大鼠較假手術(shù)組Longa神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低，MMP-2及VEGF表達(dá)水平顯著升高，提示高表達(dá)的MMP-2和VEGF可能通過(guò)誘導(dǎo)血管發(fā)生而在神經(jīng)保護(hù)中起著重要作用。Romanic 等[10]觀察到大鼠腦缺血后24 h MMP-2出現(xiàn)在梗死區(qū)巨噬細(xì)胞,其活性在第5天達(dá)到高峰，故認(rèn)為MMP-2 可能有助于巨噬細(xì)胞向缺血區(qū)域的轉(zhuǎn)移，其主要功能為吞噬細(xì)胞碎片和壞死機(jī)體組織，有助于組織損傷的修復(fù)。

MMP-2 在HIBD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起著雙重作用，HIBD早期，MMP-2參與降解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜，導(dǎo)致血腦屏障結(jié)構(gòu)及功能受損；而在HIBD晚期，MMP-2可能促進(jìn)突觸再生、新生血管生成，有利于神經(jīng)修復(fù)?，F(xiàn)在許多研究應(yīng)用MMPs抑制劑，通過(guò)其抑制MMPs表達(dá)起到保護(hù)血腦屏障作用。但考慮到MMP-2的雙重作用，在MMPs抑制劑運(yùn)用到臨床治療前還需進(jìn)行更進(jìn)一步研究，如其治療HIE最佳時(shí)間窗的選擇。同時(shí)鑒于MMP-2在HIBD晚期的保護(hù)作用，MMPs或類似物的應(yīng)用可能為HIE的治療開(kāi)辟新的道路，同樣其神經(jīng)修復(fù)的具體機(jī)制仍需更深入的探索。

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Expression and significance of MMP-2 in the hippocampus of neonatal rats after hypoxia-ischemia brain damage

YinJie1,ChenRong2,XiaoDongfan1.

1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China. 2.DepartmentofNeonatal,People'sHospitalofGuizhouProvince,Guiyang550002,China.

Objective To explore the expression and significance of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) in hypoxia-ischemia injury with infant rats. Methods 42 neonatal SD rats of 7 days old were randomly divided into sham operation group and hypoxia-ischemia brain damage model group, the latter group was further divided into six subgroups based on different time points following HIBD ( 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 3 d, 7 d) (n=6 in each group), the expression of MMP-2 was determined by immunohistochemical method. Results The expression of MMP-2 protein increased gradually after HIBD and showed a slow growth trend in 24 h group to 3 d group, and reached the peak at 7 d. Compared with the sham group, there was statistical significantly differences (P<0.05) in the MMP2 expression in 24 h,48 h, 3 d,7 d groups. Conclusion The expression of MMP-2 have changed differently at various level after HIBD which may be participated the development process of HIBD, and MMP-2 may also be involved in the repair of brain injury.

Matrix metalleproteinase-2； Hypoxia-ischemia brain damage； Neonatal rats； Hippocampus

貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目[黔科合J字(2008)2308號(hào)]

R722.19

A

1002-6975(2016)04-0348-03

2015-09-21)

△通信作者，E-mail：chenr9999@yahoo.com.cn