王偲穎 林靖 韓媛媛 張華 黃盛文△

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬貴州省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬貴州省人民醫(yī)院輸血科，貴州 貴陽(yáng) 550002)

·論 著·

陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)肽核酸轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞的研究

王偲穎1林靖2韓媛媛1張華1黃盛文1△

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬貴州省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬貴州省人民醫(yī)院輸血科，貴州 貴陽(yáng) 550002)

目的 優(yōu)化陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)肽核酸(PNA)轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞的條件。方法 以陽(yáng)離子脂質(zhì)體lipofectamine 2000為載體，將標(biāo)記有FITC熒光基團(tuán)的PNA轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察并計(jì)算其轉(zhuǎn)染效率，采用Cell Counting Kit(CCK-8)檢測(cè)其細(xì)胞毒性。應(yīng)用正交試驗(yàn)篩選出最佳的PNA和脂質(zhì)體的用量及比例，并優(yōu)化稀釋用培養(yǎng)基血清濃度，以獲得最優(yōu)的轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果 以2.5×105/mL～3×105/mL的細(xì)胞密度接種，100 μL/孔的培養(yǎng)基中加入PNA 6.25 pmol，PNA與脂質(zhì)體的體積比為1∶3.5，稀釋用培養(yǎng)基未加胎牛血清時(shí)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性最佳，轉(zhuǎn)染效率為87.2%，細(xì)胞存活率(RGR)為94.1%。結(jié)論 PNA可通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染進(jìn)入K562細(xì)胞，優(yōu)化條件后得到的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率能夠滿足基因表達(dá)研究的實(shí)驗(yàn)要求。

K562細(xì)胞； 肽核酸； 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染； 細(xì)胞毒性

β-地中海貧血(簡(jiǎn)稱β地貧)是我國(guó)南方各省常見(jiàn)的常染色體隱性遺傳病，目前尚無(wú)有效的根治方法[1]。重新激活β地貧患者體內(nèi)的γ-珠蛋白基因表達(dá)，提高HbF的合成量是治療這類疾病的重要策略[2]。PYR是一種SWI/SNF類染色質(zhì)重組復(fù)合體，通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子Ikaros與相應(yīng)的DNA序列結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在δ-珠蛋白基因上游1 kb處一段250 bp長(zhǎng)富含嘧啶堿基的序列。研究[3]表明，PYR與相應(yīng)DNA序列結(jié)合在γ→β珠蛋白基因的轉(zhuǎn)換過(guò)程中起重要作用。我們?cè)O(shè)想與這一序列特異性結(jié)合的肽核酸(PNA)可有效阻斷γ→β珠蛋白基因的轉(zhuǎn)換，使γ-珠蛋白基因持續(xù)高表達(dá)。本研究以陽(yáng)離子脂質(zhì)體lipofectamine 2000為載體，介導(dǎo)特異性設(shè)計(jì)的PNA轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，通過(guò)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,以期待獲得相對(duì)較高的轉(zhuǎn)染效率和較低的細(xì)胞毒性，為進(jìn)一步研究PNA對(duì)γ-珠蛋白基因表達(dá)的影響奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 K562細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；PNA由成都川抗派德生物技術(shù)有限公司合成；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自invitrogen公司；Cell Counting Kit(CCK-8)購(gòu)自東仁化學(xué)科技(上海)有限公司；胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物技術(shù)有限公司；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；倒置顯微鏡OLYMPUS-IX51-FL(OLYMPUS公司)；熒光顯微鏡OLYMPUS-BX61(OLYMPUS公司)；酶標(biāo)儀MULTISKAN FC型(Thermo公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱IGO150型(Thermo公司)。

1.2 PNA設(shè)計(jì) 本研究所設(shè)計(jì)的PNA序列為5’- TCCTTCTTCTCCTCCA，與PYR的DNA結(jié)合序列互補(bǔ)，用于阻斷γ→β珠蛋白基因開(kāi)關(guān)。PNA的5’端標(biāo)記有FITC熒光基團(tuán)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) K562細(xì)胞用含10%胎牛血清的改良型1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)液中青霉素和鏈霉素各100 U/mL,于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，在飽和濕度條件下培養(yǎng)，在細(xì)胞匯合率90%左右可傳代或者進(jìn)行轉(zhuǎn)染及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按照3個(gè)因素3個(gè)水平(表1)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，共有9種不同條件的組合(F1～F9)，用于篩選細(xì)胞轉(zhuǎn)染的最佳的PNA和脂質(zhì)體濃度及轉(zhuǎn)染時(shí)間。正交實(shí)驗(yàn)的各實(shí)驗(yàn)組，在轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞用不含抗生素的改良型1640培養(yǎng)基洗滌重懸3次，用不含雙抗的含10%胎牛血清的改良型1640培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d。然后以2.5×105～3×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于96孔板，100 μL/孔培養(yǎng)24 h。分別用25 μL的含10%胎牛血清的改良型1640培養(yǎng)基稀釋不同濃度的PNA和脂質(zhì)體，3 min后將稀釋的PNA和脂質(zhì)體混合并孵育25 min，再將50 μL的PNA脂質(zhì)體混合物加入96孔板中，分別轉(zhuǎn)染24、36、48 h后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察和分析，每個(gè)條件組合做5個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞因帶有FITC熒光基團(tuán)呈綠色，未轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞呈藍(lán)色。轉(zhuǎn)染效率(%)=(綠色熒光細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

表1 正交試驗(yàn)的因素和水平

注：*體積比，PNA母液濃度為0.05 nmol/μL。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率測(cè)定 轉(zhuǎn)染時(shí)間到后收集各組細(xì)胞懸液10 000r/min 離心2 min，棄掉多余上清只留取200 μL上清將離心的轉(zhuǎn)染細(xì)胞吹散打勻制成玻片在熒光顯微鏡(OLYMPUS-BX61)下觀察，在物鏡10×和目鏡15×放大倍數(shù)DAPI系統(tǒng)下拍照，綠色熒光下計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞，紫外光下計(jì)數(shù)總細(xì)胞，綠色熒光陽(yáng)性的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比即為轉(zhuǎn)染效率，每次實(shí)驗(yàn)隨機(jī)觀察4個(gè)視野取其平均值用于轉(zhuǎn)染效率的統(tǒng)計(jì)。

1.6 細(xì)胞毒性測(cè)定 細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)設(shè)置空白調(diào)零孔和對(duì)照組?？瞻渍{(diào)零孔即鋪板時(shí)不加細(xì)胞只加入100 μL培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)染時(shí)不加PNA和脂質(zhì)體，只加入50 μL的1640培養(yǎng)基；對(duì)照組即在轉(zhuǎn)染時(shí)不加PNA和脂質(zhì)體，只加入50 μL的1640培養(yǎng)基。到轉(zhuǎn)染時(shí)間后，每孔按10%反應(yīng)體系體積的量加入CCK-8試劑，孵育合適時(shí)間[保證測(cè)試孔吸光度值(OD值)在0.8～1.5]后，用空白調(diào)零孔進(jìn)行調(diào)零，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定每孔的OD值，并根據(jù)吸光度值計(jì)算其細(xì)胞抑制率以得出其RGR值。細(xì)胞抑制率=[(對(duì)照孔OD值-實(shí)驗(yàn)孔OD值)/對(duì)照孔OD值]×100%，細(xì)胞存活率RGR=(1-細(xì)胞抑制率)。

1.7 稀釋用培養(yǎng)基血清濃度的優(yōu)化 在轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞用不含抗生素的1640培養(yǎng)基洗滌重懸3次，用不含雙抗的含10%胎牛血清的改良型1640培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d。然后以2.5×105～3×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于96孔板，100 μL/孔培養(yǎng)24 h。分別用25 μL的含4種不同濃度胎牛血清(分別為0%、10%、20%和30%)的改良型1640培養(yǎng)基稀釋按正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果所得最佳的PNA和脂質(zhì)體濃度組合，3 min后將稀釋的PNA和脂質(zhì)體混合并孵育25 min，然后將50 μL的PNA脂質(zhì)體混合物加入96孔板中，5 h后每孔加入50 μL胎牛血清。轉(zhuǎn)染48 h后測(cè)定其轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性，篩選出轉(zhuǎn)染效率高且細(xì)胞毒性低的稀釋用培養(yǎng)基血清濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 正交表采用極差分析法計(jì)算分析，總結(jié)各因素對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞毒性的影響，篩選出轉(zhuǎn)染效率高且細(xì)胞毒性在20%以內(nèi)的組合。

2 結(jié) 果

2.1 PNA和脂質(zhì)體濃度及比例 PNA加入量越多，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率越高，但細(xì)胞毒性也隨之增大，轉(zhuǎn)染48 h的轉(zhuǎn)染效率最高(表2)。根據(jù)轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性進(jìn)行綜合判斷，最佳的條件組合為F5 (A2B2C3)，即PNA加入量為6.25 pmol/孔(PNA母液濃度為0.05 nmoL/μL)，脂質(zhì)體量為0.437 5 μL，PNA與脂質(zhì)體的體積比為1∶3.5，轉(zhuǎn)染時(shí)間為48 h。這一條件所得轉(zhuǎn)染效率為57.8%，細(xì)胞抑制率為19.7%。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 稀釋用培養(yǎng)基血清濃度的優(yōu)化結(jié)果 以正交試驗(yàn)所得最佳條件(A2B2C3)為基礎(chǔ)，不同血清濃度的培養(yǎng)基稀釋脂質(zhì)體和PNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可以看出，4種稀釋脂質(zhì)體和PNA的培養(yǎng)基中，不含胎牛血清的轉(zhuǎn)染效率最高且毒性最小，轉(zhuǎn)染效率為87.2%，細(xì)胞毒性5.9%，即RGR=94.1%。這一轉(zhuǎn)染條件的熒光顯微鏡下細(xì)胞見(jiàn)圖1。

表3 稀釋用培養(yǎng)基血清濃度優(yōu)化結(jié)果

注：藍(lán)色細(xì)胞加綠色熒光細(xì)胞為總細(xì)胞數(shù)，藍(lán)色細(xì)胞為未轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞，綠色熒光細(xì)胞為轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞。圖1 熒光顯微鏡轉(zhuǎn)染細(xì)胞(10×15)

3 討 論

細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)是研究特定的基因表達(dá)調(diào)控及基因治療的重要技術(shù)之一, 選擇合適的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法對(duì)提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染率至關(guān)重要。陽(yáng)離子脂質(zhì)體屬于無(wú)反應(yīng)活性的立體穩(wěn)定脂質(zhì)體，能夠轉(zhuǎn)運(yùn)DNA、RNA、核糖體及其它大電荷分子和大分子等物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，而且轉(zhuǎn)染效率也較高,因此被廣泛應(yīng)用于各種細(xì)胞的轉(zhuǎn)染[4]。陽(yáng)離子脂質(zhì)體作為基因轉(zhuǎn)染載體的特點(diǎn)是載體與目的基因以靜電作用相結(jié)合,攜帶的外源基因容量較大,不含抗原成分,細(xì)胞毒性低,可被機(jī)體降解,可進(jìn)行多次反復(fù)轉(zhuǎn)染,因此是一種有臨床應(yīng)用潛力的基因轉(zhuǎn)染載體[5]。

肽核酸(PNA)是以肽骨架取代DNA中脫氧核糖磷酸酯骨架的DNA類似物，其主鏈骨架是由重復(fù)的N-(2-氨基乙基)甘氨酸殘基通過(guò)酰胺鍵連接而成，而堿基是通過(guò)亞甲基羰基連接到PNA分子的主鏈骨架上[6]。由于PNA生物性質(zhì)穩(wěn)定，不被核酸酶和蛋白酶消化降解，能以極高的序列特異性與DNA、RNA和PNA雜交形成極其穩(wěn)定的二聚體或三聚體，已在基因診斷、基因治療、癌基因研究以及反義藥物等分子生物學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[7]。介導(dǎo)PNA進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染的常見(jiàn)方法有磷酸鈣沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電穿孔法、超聲靶向轉(zhuǎn)染法等，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染由于其高轉(zhuǎn)染效率及低細(xì)胞毒性、易于優(yōu)化操作等優(yōu)點(diǎn)而在細(xì)胞轉(zhuǎn)染中得到廣泛應(yīng)用[8-9]。基因轉(zhuǎn)染過(guò)程中影響因素很多，不同細(xì)胞類型或不同細(xì)胞系所需要考慮的因素也不一樣 ,在不同培養(yǎng)條件下的轉(zhuǎn)染方法也有一定的差異[5]。本研究通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)的方法探尋了轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞時(shí)肽核酸、脂質(zhì)體的用量、比例和轉(zhuǎn)染時(shí)間等因素。結(jié)果表明隨著PNA用量增多，轉(zhuǎn)染效率升高，但是細(xì)胞毒性也會(huì)隨之增大；PNA和脂質(zhì)體體積比為1∶3.5時(shí)轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性的綜合結(jié)果最好。

考慮到稀釋孵育PNA和脂質(zhì)體過(guò)程中，用于稀釋的培養(yǎng)基血清濃度會(huì)影響到PNA脂質(zhì)體復(fù)合物的形成[10]，為進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)染效率降低細(xì)胞毒性，本研究對(duì)轉(zhuǎn)染過(guò)程中的稀釋用的培養(yǎng)基血清濃度進(jìn)行了優(yōu)化，最后得出用不含胎牛血清的培養(yǎng)基稀釋孵育脂質(zhì)體和PNA，在轉(zhuǎn)染5 h后再加入血清(此時(shí)加入血清并加大其用量的目的是為了給轉(zhuǎn)染細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)，以降低其細(xì)胞毒性)，最終得到較為理想的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率(RGR)，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到88.2%，RGR為94.1%,根據(jù)美國(guó)藥典細(xì)胞毒性分級(jí)：RGR在80%～100%為Ⅰ級(jí)細(xì)胞,能夠滿足下一步的科學(xué)研究。本研究經(jīng)轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化，與同類型文獻(xiàn)報(bào)道相比，本研究所得轉(zhuǎn)染效率要更高而細(xì)胞毒性則更小，所得轉(zhuǎn)染效率和RGR能夠滿足進(jìn)一步研究PNA對(duì)γ-珠蛋白基因表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)要求。

[1] 黃艷環(huán)，陸泠羽，蘇國(guó)生，等. β-地中海貧血臨床診治研究進(jìn)展[J].慢性性病學(xué)雜志，2014,15(8):619-622.

[2] Bank A. Regulation of human fetal hemoglobin: new players, new complexities[J].Blood，2006，107(2):435-443.

[3] Lopez RA, Schoetz S, DeAngelis K, et al. Multiple hematopoietic defects and delayed globin switching in ikaros null mice[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2002,99(2):602-607.

[4] 楊云廷，付崇羅. 陽(yáng)離子脂質(zhì)體lipofectamine2000對(duì)PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的研究[J].生物技術(shù)通報(bào)，2011(5):231-235.

[5] 孫瑞琳，金發(fā)光，吾道澄，等. 多聚胺陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞毒性的評(píng)價(jià)[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2006,31(4):327.

[6] 季軍，潘一峰，何霞，等. 超聲靶向轉(zhuǎn)染c-myc基因的反義肽核酸抑制兔髂動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增生的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2015,25(2):33.

[7] 王建華，郭澤琴. 肽核酸在分子生物學(xué)技術(shù)中的應(yīng)用[J].中國(guó)生物工程雜志,2013,33(1):90-94.

[8] 張禾璇，單可人，何燕，等. 脂質(zhì)體法與電穿孔法轉(zhuǎn)染兩種細(xì)胞效率的比較[J].重慶醫(yī)學(xué)，2014,43(33):4432-4433.

[9] 段艷,王冰,崔韶輝，等. 陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 Hela 細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù), 2009,13(11):2119.

[10]劉思汝,李林鮮,吳國(guó)球. 新型陽(yáng)離子核酸載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率研究[J].安徽醫(yī)學(xué)，2014,35(12):1635.

Experimental study on peptide nucleic acid transfection into K562 cells mediated by cationic liposome

WangSiying1,LinJing2,HanYuanyuan1,ZhangHua1,HuangShengwen1.

1.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedGuizhouProvincialPeople'sHospital,GuizhouMedicialUniversity,Guiyang550002,China. 2.DepartmentofBloodTransfusion,AffiliatedGuizhouProvincialPeople'sHospital,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550002,China.

Objective Abstract Objective To optimize the transfection conditions for peptide nucleic acid (PNA) into K562 cells mediated by cationic liposome. Methods With the cationic liposome lipofectamine 2000 used as vector, PNAs marked by FITC fluorophore were transfected into K562 cells. Transfection efficiency was calculated according to the observation of cells under fluorescence microscope, and cytotoxicity was examined using Cell Counting Kit (CCK-8). In order to achieve the best transfection results, the dose and proportion of PNA and liposomes were optimized by orthogonal experiment, as well as the serum concentration in medium used as dilution was optimized. Results When the cells with the density of 2.5×105/mL-3×105/mL were cultured, the optimized transfection conditions were as follow: each 100 μl medium added with 6.25pmol PNA, the volume proportion of PNA to liposomes was 1∶3.5, and the medium used as dilution had no fetal bovine serum. Under these conditions, the best transfection results were achieved, with a transfection efficiency of 87.2% and a relative growth rate (RGR) of 94.1%. Conclusion PNA could be transfected into K562 cells mediated by cationic liposome. The cells transfection efficiency and RGR achieved under the optimized transfection conditions could satisfy the requirement of gene expression research.

K562 cell； Peptide nucleic acid； Liposome transfection； Cytotoxicity

貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長(zhǎng)專項(xiàng)資金(黔省專合字201088號(hào))

R394.3

A

1000-744X(2016)04-0341-03

2015-09-25)

△通信作者，E-mial:hsw713@sina.com