張艷霞，朱彩平，鄧紅，張曉，李云，張揚(yáng)，翟希川

(陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安，710119)

超聲輔助雙水相提取石榴皮多酚

張艷霞，朱彩平*，鄧紅，張曉，李云，張揚(yáng)，翟希川

(陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安，710119)

采用超聲輔助雙水相法提取石榴皮多酚，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取超聲時間、超聲溫度、(NH4)2SO4用量和液料比為自變量，石榴皮多酚得率為響應(yīng)值，通過Box-Behnken試驗設(shè)計及響應(yīng)面分析法，研究各單因素及其交互作用對多酚得率的影響，優(yōu)化石榴皮多酚的提取工藝條件。研究結(jié)果表明:最佳的提取工藝參數(shù)為,超聲時間32 min、超聲溫度40 ℃、(NH4)2SO4用量0.36 g/mL、液料比為37∶1(mL∶g)，在此條件下提取，多酚的得率為(10.63±0.28)%(n=3)，與模型的預(yù)測值10.708 6%有較好的擬合性，表明超聲輔助雙水相提取石榴皮多酚的方法可行。

石榴皮；多酚；超聲輔助雙水相；響應(yīng)面分析

石榴，又名安石榴，是傳統(tǒng)的藥食同源食品,其藥用和食用價值的發(fā)掘日益受到全球相關(guān)領(lǐng)域的重視[1]。據(jù)記載，石榴皮作為我國傳統(tǒng)的中藥材，具有澀腸止瀉、止血、驅(qū)蟲的功效，可以用于治療久瀉、久痢、便血、脫肛、崩漏、帶下、蟲積腹痛等疾病[2]。隨著中國果汁加工產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，每年會產(chǎn)生大量的石榴皮副產(chǎn)物，其中除去一小部分用作中藥材之外，剩余的或作為牛的飼料，或直接被廢棄[3]。

石榴皮中含有大量的多酚類物質(zhì)，是其發(fā)揮藥理作用的主要活性成分，目前對石榴皮多酚提取的方法有多種[4]。近幾年，隨著“綠色化學(xué)”概念的提出，環(huán)境友好型的提取工藝備受青睞[5]。超聲輔助提取是目前應(yīng)用最廣泛的一種提取技術(shù)，不僅可以提高產(chǎn)品的得率，縮短提取時間，還可以減少化學(xué)與物理危害[6]；雙水相提取是根據(jù)被分離物質(zhì)在上下相中的分配系數(shù)不同，從而實現(xiàn)分離的一種方法[7]，近年來，醇-鹽雙水相體系已經(jīng)被廣泛用于提取和分離草本植物中的天然小分子物質(zhì)[8-9]，其優(yōu)點(diǎn)為形成雙水相的溶劑成本低，而且有利于醇類的回收和目標(biāo)物的分離[10]。在本研究中，選擇室溫溶解度高、溫度效應(yīng)低的(NH4)2SO4為鹽析相，依據(jù)其水化作用與乙醇形成穩(wěn)定的雙水相體系，并首次將超聲輔助與雙水相2種方法相結(jié)合進(jìn)行石榴皮多酚的提取，并采用響應(yīng)面分析法進(jìn)行工藝參數(shù)的優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

石榴：產(chǎn)自臨潼，凈皮甜品種，購于西安水果市場，要求新鮮無斑，除去病果和裂果，洗凈，進(jìn)行手工剝皮；石榴皮經(jīng)自然干燥，粉碎過40～60目篩，避光保存，備用。

試劑：無水乙醇，(NH4)2SO4，福林酚試劑，無水Na2CO3，以上均為分析純；沒食子酸(標(biāo)品)。

儀器：高速萬能粉碎機(jī)，BS 224 S電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；KQ5200DE數(shù)控超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ循環(huán)水多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；Multiskan Go全波長酶標(biāo)儀，美國熱電公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乙醇-硫酸銨雙水相體系的建立與石榴皮多酚提取

稱取1.00 g的石榴皮粉末于100 mL錐形瓶中，分別加入25 mL體積分?jǐn)?shù)為30%～70%的乙醇溶液，然后分別加入用量為0.2～0.5 g/mL (NH4)2SO4(每毫升水加入硫酸銨的質(zhì)量)，搖勻靜置30 min，在超聲溫度60 ℃、功率150 W條件下提取30 min，抽濾，將溶液移入分液漏斗中靜置分層，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時能較好地形成雙水相體系，(NH4)2SO4量在0.325～0.45 g/mL內(nèi)形成的雙水相體系較穩(wěn)定，因此，本試驗將固定乙醇的體積分?jǐn)?shù)在40%進(jìn)行后續(xù)研究。取上層溶液1 mL于100 mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，即石榴皮粗多酚稀釋溶液，備用。

1.2.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.100 0 g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水溶解，定容至100 mL，搖勻，制備成1 000 mg/L的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液槍分別移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL標(biāo)準(zhǔn)液于50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，得到濃度分別為0、10、20、30、40、50、60 mg/L的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 最佳測定波長的確定

分別吸取上述濃度為20 mg/L的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和石榴皮粗多酚稀釋溶液1 mL于10 mL離心管中，分別加入蒸餾水5 mL，F(xiàn)olin-Ciocalteu試劑(加水稀釋10倍)1 mL，搖勻，再加入7.5% Na2CO3溶液3 mL，充分混合后在室溫下避光靜置2 h，用酶標(biāo)儀分別對沒食子酸及石榴皮多酚反應(yīng)液在波長400～900 nm內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，最終得出在750 nm處有最大吸收峰，如圖1所示。

圖1 沒食子酸反應(yīng)液與石榴皮多酚反應(yīng)液光譜掃描Fig.1 Scanning spectra of pyrogallic acid and pomegranate peel polyphenols

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取不同濃度的沒食子酸溶液1 mL于10 mL的離心管中，按上述1.2.3方法操作，在750 nm處測其吸光值，重復(fù)3次，取平均值。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=0.004 4x+0.007 0，R2=0.996 0，式中：y，吸光度；x，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(mg/L)。

1.2.5 石榴皮多酚含量的測定

稱取2.00 g石榴皮粉末于100 mL錐形瓶中，加入硫酸銨試劑，再按一定的液料比加入一定體積的雙水相溶液，在超聲輔助提取。抽濾，靜置分層，記錄上層溶液體積，按1.2.4操作，得出吸光值，根據(jù)回歸方程得出多酚的質(zhì)量濃度，由公式(1)計算多酚得率：

(1)

式中：c,由回歸方程中算得的多酚質(zhì)量濃度,mg/L；V,乙醇層提取液總體積mL；n,稀釋倍數(shù),100；m,稱取石榴皮粉末質(zhì)量,g。

1.2.6 試驗因素的確定

影響超聲輔助雙水相提取石榴皮多酚的因素很多，如超聲時間、(NH4)2SO4用量、超聲溫度及液料比等。因此本試驗固定石榴皮粉末2.00g，選擇雙水相體系中乙醇的體積分?jǐn)?shù)為40%，超聲功率150W。通過改變超聲時間(10、20、30、40、50、60min)，超聲溫度(20、30、40、50、60、70 ℃)，(NH4)2SO4用量(0.30、0.325、0.35、0.375、0.40、0.425g/mL)和液料比[20、25、30、35、40、45)∶1(mL∶g)]來研究各單因素對多酚得率的影響。

1.2.7 響應(yīng)面試驗

在單因素的基礎(chǔ)上，綜合考慮各單因素對石榴皮多酚得率的影響，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，選擇超聲時間、超聲溫度、硫酸銨用量、液料比進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析，來確定石榴皮多酚最佳提取條件，因素水平表見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計試驗因素水平及編碼

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 超聲時間對多酚得率的影響

由圖2可看出，在超聲時間低于30 min時，石榴皮多酚得率隨著時間的延長而迅速增大。這是因為隨著時間的延長，可以使多酚充分的溶解到乙醇中，當(dāng)?shù)竭_(dá)30 min時得率達(dá)到最大，說明已完全溶解，再延長超聲時間，多酚得率反而下降，可能是由于多酚的不穩(wěn)定，在氧氣和光照條件下發(fā)生氧化、聚合等反應(yīng)才導(dǎo)致得率的下降，因此，超聲提取的時間不宜過長。

圖2 超聲時間對多酚得率的影響Fig.2 The effect of ultrasonic time on the yield of polyphenols

2.1.2 超聲溫度對多酚得率的影響

圖3顯示，隨著溫度的增加多酚得率增大，當(dāng)溫度升高到40 ℃時，石榴皮多酚得率最高，但繼續(xù)升高溫度多酚得率迅速下降。因為溫度升高，分子內(nèi)能增大，分子運(yùn)動加快，有利于分子滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)破壞疏水鍵，同時，也有利于被提取物向溶液中擴(kuò)散，多酚得率增大，但隨著溫度升高使能量消耗增大、成本增加，同時較高的溫度使多酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)遭到破壞，此外在高溫條件下也會導(dǎo)致乙醇揮發(fā)，使液料比改變，從而影響多酚的得率[11-12]，并且當(dāng)溫度高于40 ℃，雙水相體系穩(wěn)定性變差，導(dǎo)致多酚物質(zhì)的氧化加快，因此，多酚得率下降。

圖3 超聲溫度對多酚得率的影響Fig.3 The effect of ultrasonic temperature on the yield of polyphenols

2.1.3 (NH4)2SO4用量對多酚得率的影響

從圖4可看出，當(dāng)(NH4)2SO4用量較小時，多酚得率隨著(NH4)2SO4用量的增大迅速上升，當(dāng)用量為0.35 g/mL時，多酚得率最高，再增大濃度得率反而下降。因為隨著(NH4)2SO4用量的增加，(NH4)2SO4對水的束縛能力增強(qiáng)，乙醇從(NH4)2SO4水相中游離出來，而水分子也離開乙醇相。其結(jié)果是上相中乙醇的相對體積分?jǐn)?shù)增加，下相中乙醇的相對體積分?jǐn)?shù)則減少。因此，(NH4)2SO4用量的改變可影響到上相的極性，最終影響到多酚在其中的分配[13]。

圖4 硫酸銨用量對多酚得率的影響Fig.4 The effect of ammonium sulfate dosage on the yield of polyphenols

2.1.4 液料比對多酚得率的影響

由圖5可知，在液料比較小時，石榴皮多酚得率隨著液料比的增大而迅速增大，當(dāng)液料比大于35∶1(mL∶g)時，多酚得率增加速度明顯降低。主要原因可能是，溶劑用量越多，傳質(zhì)動力越大，擴(kuò)散到溶劑里的多酚類化合物就越多[14]。但是在固液兩相之間，除了擴(kuò)散溶解平衡外，還存在吸附平衡，低溫有利于吸附。由于液料比的增大，在產(chǎn)生相同熱量的條件下，提取液溫度下降，吸附作用增強(qiáng)導(dǎo)致得率下降[15]。

圖5 液料比對多酚得率的影響Fig.5 The effect of solid-liquid ratio on the yield ofpolyphenols

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

2.2.1 試驗結(jié)果

響應(yīng)面結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

續(xù)表2

試驗號ABCD多酚得率(Y)/%920400353095210404003530933112040035401003124040035401037133030032535937143050032535100215303003753510341630500375359781720400325351001184040032535101919204003753510252040400375351027213030035309432230500353092723303003540980243050035401007253040035351066263040035351074273040035351056283040035351043293040035351065

注：表2中多酚得率數(shù)據(jù)為3 次重復(fù)試驗的平均值。

如表2所示，共29個試驗點(diǎn)，其中24個為析因點(diǎn)，5個為零點(diǎn)，析因點(diǎn)為自變量取值在A、B、C、D所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，其中零點(diǎn)試驗重復(fù)5次，用以估算試驗誤差。

2.2.2 模型的建立及其顯著性檢驗

將表2所得的試驗數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行多元回歸分析，得到石榴皮多酚得率(Y)對超聲時間(A)、超聲溫度(B)、(NH4)2SO4用量(C)和液料比(D)的二次多項回歸模型如下：

Y=10.61+0.081A+0.028B+0.14C+0.31D+0.22AB-0.040AC+0.13AD-0.30BC+0.11BD+0.11CD-0.25A2-0.49B2-0.20C2-0.50D2

(2)

對回歸模型進(jìn)行方差分析，得到結(jié)果如表3。

表3 響應(yīng)面試驗方差分析

注：*為差異顯著(P<0.05)，**為差異高度顯著(P<0.01)，***為差異極度顯著(P<0.000 1)。

2.2.3 石榴皮多酚提取工藝的響應(yīng)面分析

對響應(yīng)面方差分析結(jié)果做響應(yīng)曲面及等值線圖(圖6～圖11)，響應(yīng)曲面圖是任意2個變量在零水平時，其余2個變量對多酚得率交互作用的影響?？梢钥闯觯我?個單因素之間都存在交互作用，最佳落點(diǎn)均在試驗考察的區(qū)域內(nèi)。等值線圖越圓，說明對多酚得率的影響越小，等值線圖越扁平，表示因素間的相互影響越大。

圖6為(NH4)2SO4用量0.35 g/mL，液料比35∶1(mL∶g)時，超聲時間與超聲溫度交互作用對石榴皮多酚得率影響的響應(yīng)面圖和等值線圖。由圖6可看出，當(dāng)超聲時間一定時，隨著超聲溫度的增加，多酚得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，而當(dāng)超聲溫度一定時，隨著超聲時間的增大，多酚得率也呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，但是變化幅度較超聲溫度小，因此，等值線呈現(xiàn)橢圓形狀，超聲時間與超聲溫度交互作用對多酚得率影響高度顯著。

圖6 超聲時間與超聲溫度交互影響多酚得率的響應(yīng)面圖與等值線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effects of ultrasonic time and ultrasonic temperature on the yield of polyphenols

圖7為超聲溫度40 ℃、液料比35∶1(mL∶g)時，超聲時間與(NH4)2SO4用量交互作用對石榴皮多酚得率影響的響應(yīng)面圖與等值線圖。由圖7可知，當(dāng)超聲時間一定時，多酚得率隨著硫酸銨用量的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢；當(dāng)(NH4)2SO4用量一定時，隨著超聲時間的增大，石榴皮多酚的得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但變化不顯著；由表3可知，超聲時間與硫酸銨用量交互作用對石榴皮多酚得率影響不顯著。在超聲時間為30～35 min，(NH4)2SO4用量0.35～0.36 g/mL時，響應(yīng)值最大。

圖7 超聲時間與(NH4)2SO4用量交互影響多酚得率的響應(yīng)面圖與等值線圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effects of ultrasonic time and ammonium sulfate dosage on the yield of polyphenols

圖8為超聲溫度40 ℃，(NH4)2SO4用量0.35 g/mL時，超聲時間與液料比交互作用對石榴皮多酚得率影響的響應(yīng)面圖與等值線圖。由圖8可看出，當(dāng)超聲時間一定時，隨著液料比的增加，多酚得率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，變化較明顯；當(dāng)液料比一定時，多酚得率隨著超聲時間的增加先增大后減小，變化幅度較小；當(dāng)超聲時間在30～35 min時，液料比為(35～38)∶1(mL∶g)時，響應(yīng)值最高，即多酚得率最高。

圖8 超聲時間與液料比交互影響多酚得率的響應(yīng)面圖與等值線圖Fig.8 Response surface and contour plots for the effects of ultrasonic time and material/liquid ratio on the yield of polyphenols

圖9為超聲時間30 min，液料比35∶1(mL∶g)時，超聲溫度與(NH4)2SO4用量交互作用對石榴皮多酚得率影響的響應(yīng)面圖與等值線圖。從圖9中可看出，當(dāng)超聲溫度一定時，多酚得率隨著(NH4)2SO4用量的增加而呈線性增大，最終趨于平穩(wěn)，而當(dāng)(NH4)2SO4用量一定時，隨著超聲溫度的增加多酚得率呈現(xiàn)先迅速增加后緩慢降低，當(dāng)(NH4)2SO4用量處于較低水平時，超聲溫度的響應(yīng)拋物曲線的最高點(diǎn)也處于較低水平，而隨著(NH4)2SO4用量的增大，超聲溫度的響應(yīng)拋物曲線最高點(diǎn)也向高水平移動，等值線呈橢圓形；同時由表3可知，超聲溫度與(NH4)2SO4用量交互作用對多酚得率影響極顯著；響應(yīng)值在超聲溫度為40 ℃左右，(NH4)2SO4用量為0.36 g/mL左右，響應(yīng)值最高。

圖9 超聲溫度與(NH4)2SO4用量交互影響多酚得率的響應(yīng)面圖與等值線圖Fig.9 Response surface and contour plots for the effects of ultrasonic temperature and ammonium sulfate dosage on the yield of polyphenols

圖10為超聲時間30 min，(NH4)2SO4用量0.35 g/mL時，超聲溫度與液料比交互作用對多酚得率影響的響應(yīng)面圖與等值線圖。由圖10可知，當(dāng)超聲溫度一定時，液料比處于低水平時，多酚得率呈現(xiàn)線性增加，當(dāng)液料比一定時，隨著超聲溫度的增加，多酚得率呈現(xiàn)先增后降的趨勢，但變化不明顯，且變化幅度稍低于液料比；由表3可知，超聲溫度與液料比交互作用對多酚得率影響不顯著。超聲溫度為40 ℃左右，液料比為(36～38)∶1(mL∶g)時，多酚得率最大。

圖10 超聲溫度與液料比交互影響多酚得率的響應(yīng)面圖與等值線圖Fig.10 Response surface and contour plots for the effects of ultrasonic temperature and material/liquid ratio on the yield of polyphenols

圖11為超聲時間30 min，超聲溫度40 ℃時，(NH4)2SO4用量與液料比交互作用對多酚得率影響的響應(yīng)面圖與等值線圖。從圖11可知，當(dāng)(NH4)2SO4用量一定時，隨著液料比的增加，多酚得率先呈線性增加后緩慢降低。由表3可知，(NH4)2SO4用量與液料比交互作用對多酚得率的影響不顯著；響應(yīng)值在(NH4)2SO4用量為0.36 g/mL左右，液料比為37∶1(mL∶g)左右，響應(yīng)值最大。

圖11 (NH4)2SO4用量與液料比交互影響多酚得率的響應(yīng)面圖與等值線圖Fig.11 Response surface and contour plots for the effects of ammonium sulfate dosage and material/liquid ratio on the yield of polyphenols

2.3 工藝優(yōu)化及驗證實驗

根據(jù)所建立的模型進(jìn)行參數(shù)最優(yōu)化分析，得到石榴皮多酚得率最高的工藝參數(shù)為：超聲時間32.22 min，超聲溫度39.83 ℃，(NH4)2SO4用量0.36 g/mL，液料比36.97∶1(mL∶g)，在此條件下，石榴皮多酚得率的預(yù)測值為10.708 6%，為方便試驗操作，將工藝參數(shù)修正為：超聲時間32 min，超聲溫度40 ℃，(NH4)2SO4用量0.36 g/mL，液料比37∶1(mL∶g)，此時，多酚的得率為(10.63±0.28)%(n=3)，與模型預(yù)測值誤差0.73%。

3 結(jié)論

本文選取超聲輔助雙水相法提取石榴皮多酚，通過試驗確定了形成穩(wěn)定雙水相的乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%，以石榴皮多酚得率為考察指標(biāo)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法對超聲輔助雙水相提取石榴皮多酚的工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳工藝參數(shù)為：超聲時間32 min、超聲溫度為40 ℃、(NH4)2SO4用量為0.36 g/mL(每毫升水(NH4)2SO4用量為0.36 g)、液料比37∶1(mL∶g)，在此條件下，石榴皮多酚得率為(10.63±0.28)%(n=3)，與模型預(yù)測值誤差0.73%，說明該模型是可靠的，能較好地預(yù)測石榴皮多酚的實際得率。

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Optimization of ultrasound assisted aqueous two-phase extraction of polyphenols from pomegranate peel by response surface methodology

ZHANG Yan-xia, ZHU Cai-ping*, DENG Hong, ZHANG Xiao, LI Yun, ZHANG Yang, ZHAI Xi-chuan

(College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710119, China)

The method of ultrasonic assisted aqueous two-phase system was used to extract polyphenols from pomegranate peel. On the basis of single-factor experiment, the best extraction technology was optimized by selecting ultrasonic time, ultrasonic temperature, ammonium sulfate dosage and liquid/material ratio as independent variables, and the yield of pomegranate peel polyphenols as the response value. Box-Behnken design and response surface analysis method were applied to evaluate the effects of each single-factor and its interaction on the polyphenols yield. The results showed that the best extraction conditions were ultrasonic time 32 min, ultrasonic temperature 40 ℃, the dosage of ammonium sulfate 0.36 g/mL (ammonium sulfate dosage 0.36 g per milliliters of water), liquid/material ratio 37(mL/g). Under these conditions, the polyphenol yield was (10.63±0.28)%(n=3), which fitted well to the predicted value of 10.708 6%. So the technology of ultrasonic assisted aqueous two-phase extract polyphenols from pomegranate peel is feasible.

pomegranate peel; polyphenols; ultrasonic assisted aqueous two-phase system; response surface analysis

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612027

碩士研究生(朱彩平副教授為通訊作者,E-mail：zcaiping@snnu.edu.cn)。

國家自然科學(xué)基金項目(31301598)；陜西省自然科學(xué)基金項目(2012JQ3014)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項資金項目(GK201402042)；國家留學(xué)基金項目(201406875010)

2016-04-21，改回日期：2016-05-17