梅花鹿血血紅素的制備探究

秦鳳賢 賈冬舒 武 軍 馬井喜 胡鐵軍 陳 巍 辛德慶 余將來(lái) 長(zhǎng)春科技學(xué)院生物食品學(xué)院

我國(guó)是人工馴化和圈養(yǎng)梅花鹿的主要國(guó)家之一，東北地區(qū)是飼養(yǎng)梅花鹿的主要聚集地，有大量的鹿血資源可供開(kāi)發(fā)利用。《本草綱目》中對(duì)鹿血有如下記載，“主陽(yáng)痿、補(bǔ)腎，止腰痛，跌傷，狂犬傷，和酒服治肺痿吐血及崩中帶下，諸氣痛欲危者飲之立愈。大補(bǔ)虛損，益精血，解痘毒、藥毒”。大量試驗(yàn)證明，鹿血具有抗衰老、補(bǔ)血、促進(jìn)代謝、增強(qiáng)自身免疫力和抗疲勞等作用，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)，如血紅素可用于治療葉琳癥、溶解瘧原蟲(chóng)，用血紅素合成葉琳系列藥物等。血紅素也應(yīng)用于食品中，血紅素鐵在食品中主要用作營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，與非血紅素鐵相比，血紅素鐵可直接被腸黏膜上皮細(xì)胞吸收，不受植酸鹽等物質(zhì)的影響。因此，用血紅素鐵制成的鐵強(qiáng)化食品是缺鐵人群的良好保健食品。

目前我國(guó)鹿血的加工方式較單一，僅限于鹿血酒和鹿血粉，而一些發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)于鹿血的利用率高達(dá)50%左右，在鹿血的研究上采用酶解和分離技術(shù)開(kāi)發(fā)肽類試劑、功能性食品或食品添加劑。因此，可利用生物的酶解技術(shù)和現(xiàn)代分離技術(shù)對(duì)鹿血蛋白進(jìn)行開(kāi)發(fā)和利用，提高產(chǎn)品的利用價(jià)值，擴(kuò)大鹿血在各個(gè)領(lǐng)域中的應(yīng)用范圍。本文通過(guò)單一酶超聲波細(xì)胞破碎法、復(fù)合酶超聲波細(xì)胞破碎法、CMC吸附法等方法提取血紅素，拓展血紅素制取的新工藝，改進(jìn)傳統(tǒng)血紅素的提取方法，提高成品鹿血血紅素的濃度。

材料與方法

材料

新鮮鹿血：東鰲集團(tuán)提供優(yōu)質(zhì)的新鮮的鹿血。

方法

1 鹿血試樣的預(yù)處理

用東鰲集團(tuán)提供優(yōu)質(zhì)的新鮮的鹿血，加入3.8%檸檬酸三鈉抗凝劑，防止出現(xiàn)凝血現(xiàn)象，4 000 r/min離心15 min，去掉上層清液收取下層血細(xì)胞，-20 ℃冷凍保存。

2 單一酶超聲波細(xì)胞破碎法

解凍預(yù)處理的鹿血試樣→加入適量去離子水，超聲波細(xì)胞破碎→離心→血紅蛋白液→調(diào)節(jié)pH值→加入風(fēng)味蛋白酶→恒溫水浴鍋水解→酶滅活→恒溫干燥→研磨→得血紅素。

3 復(fù)合酶超聲波細(xì)胞破碎法

解凍預(yù)處理的鹿血試樣→加入適量去離子水，超聲波細(xì)胞破碎→離心→血紅蛋白液→調(diào)節(jié)pH值→加入堿性蛋白酶→恒溫水浴鍋水解→調(diào)節(jié)pH值→加入風(fēng)味蛋白酶→恒溫水浴鍋水解→酶滅活→恒溫干燥→研磨→得血紅素。

4 CMC吸附法

解凍預(yù)處理的鹿血試樣→加入適量去離子水→離心→加入0.1 mL乙醇→攪拌均勻→超聲波破碎→抽濾→取濾液→調(diào)節(jié)pH值→加入CMC-Na（3%）懸浮液吸附→攪拌均勻→調(diào)節(jié)pH值到5.5→連續(xù)攪拌→高速離心→分離血紅素→洗滌→干燥得血紅素。

5 血紅素濃度的測(cè)定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確量取1、2、3、4 mL和5 mL標(biāo)準(zhǔn)血紅素試液，用0.1 mol/L NaOH溶液定容至100 mL，以0.1 mol/L NaOH溶液為空白對(duì)照在403 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度A，得回歸方程為A=0.0574C+0.0062

（2）血紅素樣品含量的測(cè)定

取干燥至恒重的血紅素樣品，充分研磨，置于燒杯中，加入0.1 mol/L NaOH溶液溶解、搖勻、過(guò)濾，在100 mL容量瓶中定容。另取10 mL待測(cè)溶液于100 mL容量瓶中定容。以0.1 mol/L NaOH為空白對(duì)照，在403 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值A(chǔ)。代入回歸方程算得血紅素含量。

試驗(yàn)結(jié)果與分析

單一酶超聲波細(xì)胞破碎法（F1）

用風(fēng)味蛋白酶酶解梅花鹿鹿血，經(jīng)正交試驗(yàn)得，pH=7.5，加入風(fēng)味蛋白酶4%，攪拌，溫度65 ℃，恒溫水浴5 h，所制得的血紅素肽吸光度見(jiàn)表1。血紅素肽呈暗紅色的粉末，粉狀有極好的細(xì)膩感。具有一般血紅素肽粉的性狀。

表1 單一酶超聲波細(xì)胞破碎法制得血紅素肽吸光度

表2 復(fù)合酶超聲波細(xì)胞破碎法制得血紅素肽吸光度

表3 CMC吸附法制得血紅素肽吸光度

表4 三種不同方法吸光度值比較

復(fù)合酶超聲波細(xì)胞破碎法（F2）

經(jīng)正交試驗(yàn)得在鹿血血紅蛋白液中，調(diào)pH至8.4，加入堿性蛋白酶3%，攪拌，于60 ℃恒溫水浴3 h；再調(diào)pH值至7.5，加入風(fēng)味蛋白酶4%，溫度調(diào)節(jié)至65 ℃，恒溫水解1.5 h，制得血紅素肽吸光度見(jiàn)表2。血紅素肽呈暗紅色的粉末，粉狀有極好的細(xì)膩感。具有一般血紅素肽粉的性狀，與單一酶超聲波細(xì)胞破碎法制得的血紅素相比，顏色較亮。

CMC吸附法（F3）

在前述條件下進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，制得血紅素肽吸光度見(jiàn)表3。血紅素肽呈暗紅色的粉末，粉狀有極好的細(xì)膩感。具有一般血紅素肽粉的性狀，與前兩種方法相比，制得的血紅素顏色較暗。

分析

將上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集整理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表4所示：

由上表給出的數(shù)據(jù)，代入線性方程，得出：

CF1=4.94μg/mL，CF2=9.80μg/mL，

CF3=7.66 μg/mL

可得出CF2＞CF3＞CF1，因此，復(fù)合酶超聲波細(xì)胞破碎對(duì)鹿血血紅素的提取效果最好。

結(jié)論

通過(guò)本試驗(yàn)了解到在鹿血血紅蛋白液中，將pH值調(diào)至7.5，加入風(fēng)味蛋白酶0.04 g，攪拌均勻，溫度調(diào)節(jié)65 ℃，恒溫水浴5 h。經(jīng)過(guò)105 ℃干燥恒重，制得血紅素肽濃度為4.94 μg/mL；在鹿血血紅蛋白液中，將pH調(diào)至8.4，加入堿性蛋白酶0.03 g，攪拌均勻，于60 ℃恒溫水浴3 h；再調(diào)節(jié)pH值至7.5，加入風(fēng)味蛋白酶4%，溫度調(diào)節(jié)至65 ℃，恒溫水解1.5 h，經(jīng)干燥恒重，制得血紅素肽濃度為9.80 μg/mL；用CMC吸附法制得的血紅素肽濃度為7.66 μg/mL。綜上所述，通過(guò)復(fù)合酶制得的血紅素肽濃度最高，為9.80 μg/mL。

長(zhǎng)春市重大科技攻關(guān)計(jì)劃，鹿血活性多肽微膠囊制備及產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)（編號(hào)：14KG070）。

武軍