■姜 燕 廖梅杰* 王印庚 李 彬 張 正 榮小軍鄒安革

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266071；2.蓬萊市安源水產(chǎn)有限公司，山東煙臺(tái) 265600）

目前，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖生物魚(yú)、蝦、貝等品種營(yíng)養(yǎng)與飼料方面的研究不斷深入，研究?jī)?nèi)容從最初的配方研究[1]、營(yíng)養(yǎng)需求研究[2-4]、資源緊缺型原料的替代研究[5-6]發(fā)展到更深層次的代謝機(jī)理的研究[7-8]。

而刺參（Apostichopus japonicus）作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中重要的養(yǎng)殖品種，隨著其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)和規(guī)模的不斷擴(kuò)大，對(duì)飼料的需求量不斷加大，其中添加比例較高的鼠尾藻（Sargassum thunbergii）、馬尾藻（Sargassum polycystum）[9-11]資源逐漸匱乏。為保證產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，業(yè)內(nèi)人士開(kāi)始著手進(jìn)行替代資源的開(kāi)發(fā)研究[9,12-13]。在探尋替代或部分替代物的同時(shí)有人發(fā)現(xiàn)飼料經(jīng)過(guò)發(fā)酵處理后投喂刺參能夠取得較好的生長(zhǎng)[14-15]。發(fā)酵飼料作為一種新型的生態(tài)健康型飼料，在畜牧養(yǎng)殖業(yè)已得到廣泛應(yīng)用[16-20]，并且具有良好的前景。但是，與畜牧業(yè)相比，微生物發(fā)酵飼料在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用相對(duì)較少[21-23]。

飼料發(fā)酵前，將原料進(jìn)行一定的消毒滅菌處理，可以殺滅飼料本身攜帶的部分微生物。常見(jiàn)的消毒滅菌方式有物理方式、化學(xué)方式、紫外線、電離輻射、濾過(guò)除菌等[24]。但是，每種方式對(duì)消毒滅菌對(duì)象都有各自的要求，并不適用于所有物品。實(shí)驗(yàn)中常用的玻璃器皿、培養(yǎng)基等一般采用高溫高壓的方式進(jìn)行消毒滅菌，而對(duì)日常飲用的牛奶則一般采用巴氏消毒法進(jìn)行消毒滅菌，這樣在保證消毒滅菌的同時(shí)又不會(huì)使消毒滅菌對(duì)象的一些性質(zhì)發(fā)生改變。在飼料的發(fā)酵中，一些專(zhuān)家、學(xué)者曾對(duì)飼料原料的前處理進(jìn)行了相關(guān)的研究[25-27]，大部分采用的是高溫高壓的方式。這種方式對(duì)原料的消毒滅菌比較徹底，但是高溫高壓容易破壞飼料中部分營(yíng)養(yǎng)，一定程度上影響發(fā)酵菌株的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響發(fā)酵的進(jìn)程。本文采用65℃濕熱滅菌30 min的方式對(duì)飼料進(jìn)行消毒滅菌，在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）[28]的作用下研究其對(duì)飼料發(fā)酵效果的影響；并利用所制備的發(fā)酵飼料對(duì)稚參進(jìn)行規(guī)?；段挂云跒榘l(fā)酵飼料在刺參保苗養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 飼料的配制及消毒滅菌處理

將飼料原料分別粉碎至200目，按表1中的配比稱(chēng)取相應(yīng)原料充分?jǐn)嚢杌靹蚝?，裝入滅菌袋于65℃下濕熱滅菌30 min，并在冷凝干燥器中冷卻，密封保存，備用。

表1 發(fā)酵原料的配方（以干物質(zhì)計(jì)，g/kg）

1.2 發(fā)酵菌液的制備

發(fā)酵用菌株為實(shí)驗(yàn)室保存的釀酒酵母，采用酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，YPD）進(jìn)行發(fā)酵菌的活化培養(yǎng)。將活化的釀酒酵母用2%生理鹽水配制成108cfu/ml的菌液，按照1%（v/v）的接種量接種于YPD液體培養(yǎng)基中，置于37℃、轉(zhuǎn)速為120 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h并作為飼料發(fā)酵用種子液。

YPD培養(yǎng)基：10 g酵母浸出粉、20 g蛋白胨、20 g葡萄糖、20 g氯化鈉、15 g瓊脂，1 000 ml蒸餾水（液體培養(yǎng)基不加瓊脂）。

1.3 養(yǎng)殖試驗(yàn)場(chǎng)地及刺參來(lái)源

發(fā)酵飼料規(guī)?；段乖囼?yàn)在煙臺(tái)市安源水產(chǎn)有限公司育苗廠進(jìn)行，保苗池規(guī)格為7.5 m3/池，每個(gè)水泥池放置52個(gè)附著框。所用的刺參苗種為該公司同一批受精卵孵化的稚參苗，苗種平均規(guī)格約為16 000頭/kg，試驗(yàn)開(kāi)始前每池的平均保苗量為3.12 kg/池。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

發(fā)酵試驗(yàn)共分A、B、C、D四組，即滅菌后發(fā)酵飼料（A）、滅菌后未發(fā)酵飼料（B）、未滅菌發(fā)酵飼料（C）和未滅菌未發(fā)酵飼料（D），其中A、B兩組的飼料原料經(jīng)過(guò)消毒滅菌處理，C、D兩組的原料未經(jīng)滅菌處理；同時(shí)，A、C兩組中按10%（V/W）的比例接入釀酒酵母種子液，B、D兩組加入等量的2%的生理鹽水。每組3個(gè)平行，用滅菌海水將配合飼料按照已建立的刺參飼料發(fā)酵工藝[將原料配制成含水量為70%的發(fā)酵底物（以干物質(zhì)計(jì)），于25℃下發(fā)酵3 d][29]進(jìn)行發(fā)酵處理。發(fā)酵期間每天按時(shí)均勻攪拌，發(fā)酵結(jié)束取相應(yīng)飼料樣本進(jìn)行檢測(cè)。

投喂試驗(yàn)設(shè)有試驗(yàn)組（投喂C組發(fā)酵飼料）和對(duì)照組（投喂D組未滅菌未發(fā)酵飼料），每組26個(gè)平行，試驗(yàn)周期為35 d。在育苗廠的發(fā)酵車(chē)間，按照現(xiàn)做現(xiàn)用的原則將配合飼料按照已建立的發(fā)酵工藝進(jìn)行發(fā)酵。試驗(yàn)期間連續(xù)充氧，水溫為23～26℃，鹽度為30.61，每天投喂兩次（8:00和16:00），投喂前換水1/2。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

發(fā)酵飼料的評(píng)價(jià)指標(biāo)由發(fā)酵菌在微生物總量中所占比例、干物質(zhì)回收率（dry matter recovery，DMR）、粗蛋白含量（the content of crude protein）和感官指標(biāo)（sensory evaluation）組成[28]。

DMR：根據(jù)飼料發(fā)酵前后干物質(zhì)含量計(jì)算[30]，計(jì)算公式為：

式中：W0——發(fā)酵前飼料干物質(zhì)的含量（g）；

W1——發(fā)酵后飼料干物質(zhì)的含量（g）。

粗蛋白含量：將飼料樣品在65℃下烘干至恒重并過(guò)篩，采用凱氏定氮法測(cè)定（UDK142全自動(dòng)凱氏定氮儀，VELP，Usmate，MB，Italy）。

感官指標(biāo)：由10名研究人員組成的小組分別從氣味、顏色、黏度三個(gè)方面對(duì)發(fā)酵飼料的感官物理性狀進(jìn)行相應(yīng)的評(píng)分（評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為1.00～5.00分），氣味、顏色、黏度三個(gè)方面各自的平均值即為發(fā)酵飼料感官性狀的分值，再通過(guò)數(shù)據(jù)處理進(jìn)行分析[31-33]。其中，最佳的顏色指標(biāo)為灰棕色，最佳氣味性狀為酸香味[34]，最佳黏度指標(biāo)為飼料不成團(tuán)塊，用兩手指輕輕一捏略帶黏性。

生長(zhǎng)指標(biāo)包括增重率（Weight gate rate，WGR）、特定生長(zhǎng)率（Special growth rate，SGR），計(jì)算公式分別為：

式中：W2——試驗(yàn)開(kāi)始前每池刺參的初始平均重（kg/池）；

W3——試驗(yàn)結(jié)束時(shí)每池刺參的平均重（kg/池）；

T——試驗(yàn)周期，為35 d。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS16.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，當(dāng)不同數(shù)據(jù)間存在顯著差異時(shí)，進(jìn)行Tukey多重比較，顯著性水平為P＜0.05。所有數(shù)值均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±S.D.）”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌預(yù)處理對(duì)發(fā)酵后飼料中釀酒酵母占微生物比例的影響

滅菌后發(fā)酵飼料（A組）和未滅菌發(fā)酵飼料（C組）發(fā)酵菌在發(fā)酵樣品微生物總量中所占比例如圖1所示。其中，未滅菌發(fā)酵飼料（C組）中發(fā)酵菌的比例為（34.60±2.96）%，略高于滅菌后發(fā)酵飼料（A組）中發(fā)酵菌的比例（34.43±1.29）%，但是兩者差異不顯著（P＞0.05）。由此可見(jiàn)，滅菌預(yù)處理對(duì)發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵菌的增殖及作用影響不顯著。

2.2 滅菌預(yù)處理及發(fā)酵處理對(duì)刺參飼料理化指標(biāo)的影響

對(duì)利用滅菌預(yù)處理和發(fā)酵處理所制備的4組發(fā)酵飼料的干物質(zhì)回收率測(cè)定結(jié)果（見(jiàn)圖2）表明，滅菌后發(fā)酵飼料（A組）干物質(zhì)回收率最高[（98.09±0.36）%]，略高于未滅菌發(fā)酵飼料（C組）[（98.07±0.09）%]，但兩者的差異不顯著（P＞0.05）；然而發(fā)酵處理的兩個(gè)試驗(yàn)組（A組和C組）所制備飼料的干物質(zhì)回收率顯著高于未經(jīng)發(fā)酵處理的B組和D組（P＜0.05）。

圖1 原料滅菌處理對(duì)發(fā)酵飼料中發(fā)酵菌所占比例的影響

圖2 不同處理組飼料的干物質(zhì)回收率

對(duì)利用滅菌預(yù)處理和發(fā)酵處理所制備的4組發(fā)酵飼料的粗蛋白含量由大到小排列依次為未滅菌發(fā)酵飼料（C組）＞滅菌后發(fā)酵飼料（A組）＞未滅菌未發(fā)酵飼料（D組）＞滅菌后未發(fā)酵飼料（B組）（見(jiàn)圖3）。其中，C組與A組的粗蛋白含量分別為（20.33±0.19）%和（20.31±0.09）%，差異不顯著（P＞0.05），但二者均顯著高于未發(fā)酵的B組與D組的粗蛋白含量（P＜0.05）。

對(duì)利用滅菌預(yù)處理和發(fā)酵處理所制備的4組發(fā)酵飼料的各個(gè)感官指標(biāo)的分值結(jié)果見(jiàn)表2。在顏色和氣味方面，未滅菌發(fā)酵飼料（C組）的分值最高，與滅菌后發(fā)酵飼料（A組）差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于滅菌后未發(fā)酵飼料（B組）和未滅菌未發(fā)酵飼料（D組）（P＜0.05）；在黏度方面，4組之間差異均不顯著（P＞0.05）。

圖3 不同處理組飼料中粗蛋白含量

表2 發(fā)酵飼料的感官評(píng)價(jià)

綜合以上理化及感官指標(biāo)可以看出，飼料原料的滅菌預(yù)處理對(duì)飼料理化指標(biāo)影響不大，但發(fā)酵過(guò)程可以顯著影響飼料的干物質(zhì)回收率、粗蛋白含量、顏色和風(fēng)味，是影響飼料品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一。

2.3 發(fā)酵處理飼料投喂刺參苗種對(duì)刺參生長(zhǎng)及生理的影響

鑒于消毒處理對(duì)發(fā)酵飼料效果影響不顯著，在發(fā)酵飼料大規(guī)模應(yīng)用試驗(yàn)中，選取未滅菌發(fā)酵飼料（C組）和未滅菌未發(fā)酵飼料（D組）進(jìn)行相應(yīng)生長(zhǎng)效果的對(duì)照評(píng)估。投喂未發(fā)酵飼料的對(duì)照組和投喂發(fā)酵飼料的試驗(yàn)組刺參在試驗(yàn)初始時(shí)的平均體重差異不顯著（P＞0.05），經(jīng)過(guò)35 d的投喂試驗(yàn)，在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，投喂未滅菌發(fā)酵飼料（C組）的刺參平均每池的末體重顯著高于未滅菌未發(fā)酵飼料（D組）刺參（P＜0.05）（見(jiàn)表3）。投喂發(fā)酵飼料（C組）的養(yǎng)殖試驗(yàn)組的增重率和特定生長(zhǎng)率分別為（26.14±0.18）%和（2.11±0.04）%/d，相對(duì)于投喂未發(fā)酵飼料組（D組）的增重率[（25.40±0.18）%]和特定生長(zhǎng)率[（2.03±0.04）%/d]，兩者差異顯著（P＜0.05）。

在養(yǎng)殖試驗(yàn)過(guò)程中，同時(shí)觀察養(yǎng)殖苗種的生理狀態(tài)，并隨機(jī)挑選刺參苗種，解剖觀察其腸道以判別其攝食情況。觀察結(jié)果表明，投喂發(fā)酵飼料和未發(fā)酵飼料的刺參在體色、刺形、伸展、活力方面幾乎無(wú)差別，但在腸道充盈度方面稍微有差別，投喂發(fā)酵飼料的刺參苗種中平均20%刺參的腸道內(nèi)容物有間斷，而投喂未發(fā)酵飼料的刺參苗種中平均25%刺參的腸道內(nèi)容物有間斷（見(jiàn)表4），表明，發(fā)酵飼料對(duì)刺參苗種攝食有良好的促進(jìn)作用。

表3 投喂發(fā)酵飼料和未發(fā)酵飼料對(duì)刺參的生長(zhǎng)效果的影響

表4 試驗(yàn)過(guò)程中刺參的健康狀況

3 討論

3.1 消毒滅菌處理對(duì)飼料發(fā)酵效果的影響

2013年我國(guó)農(nóng)業(yè)部2045號(hào)公告《飼料添加劑品種目錄（2013）》中明確指出，能夠直接飼喂動(dòng)物的飼料級(jí)微生物添加劑菌種有地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、釀酒酵母（S.cerevisiae）等29種[35]。飼料原料本身攜帶的微生物種類(lèi)較多，有些在一定濃度范圍內(nèi)是刺參的有益菌，如枯草芽孢桿菌、酵母菌等；有些種類(lèi)微生物雖然不是刺參的直接有益菌，但可以產(chǎn)生氨基酸、酶、維生素等有用代謝產(chǎn)物，促進(jìn)飼料中大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的降解、發(fā)酵菌種的生長(zhǎng)繁殖；有些種類(lèi)微生物與發(fā)酵菌能夠形成頡頏作用，不利于發(fā)酵菌的生長(zhǎng)、繁殖，但是飼料中發(fā)酵菌為優(yōu)勢(shì)菌株，有可能對(duì)這些微生物的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制作用。

將原料進(jìn)行一定程度的消毒滅菌可以殺滅一些微生物，促使發(fā)酵菌快速生長(zhǎng)繁殖。但是，這種殺滅是不定向的、不具有選擇性的。有可能抑制或殺滅那些與發(fā)酵菌沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)或頡頏作用的微生物，反而使那些直接或間接的與發(fā)酵菌存在某種營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)或產(chǎn)物抑制的微生物得以存活。也有可能飼料中的微生物適溫性好，65℃下濕熱滅菌30 min對(duì)其影響較小。因此，本試驗(yàn)發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵菌所占比例在經(jīng)滅菌處理發(fā)酵飼料組和未經(jīng)滅菌處理發(fā)酵飼料組之間無(wú)明顯差異。說(shuō)明滅菌處理對(duì)發(fā)酵菌的生長(zhǎng)繁殖無(wú)明顯影響，不同處理組飼料的發(fā)酵可以正常進(jìn)行。

由于酵母菌的粗蛋白含量高達(dá)細(xì)胞干物質(zhì)的50%，所以一些酵母細(xì)胞常被用來(lái)生產(chǎn)或用作飼料蛋白。有研究指出，當(dāng)有外源氮加入的時(shí)候，將酵母菌、酵母菌和黑曲霉的混合菌液分別加入經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌處理的和未經(jīng)滅菌處理的鮮蘋(píng)果渣中進(jìn)行發(fā)酵，通過(guò)對(duì)產(chǎn)物蛋白含量的分析比較可以看出，未經(jīng)滅菌處理的產(chǎn)物純蛋白的增加幅度遠(yuǎn)高于滅菌處理的[25]。與滅菌處理相比，未經(jīng)滅菌處理的玉米秸稈的發(fā)酵液能有效的促進(jìn)大豆種子的萌發(fā)和胚根的生長(zhǎng)[36]。而本試驗(yàn)中的飼料原料采用低溫、較長(zhǎng)時(shí)間的濕熱滅菌處理，其中大部分營(yíng)養(yǎng)成分的特性不會(huì)發(fā)生變化，可以正常的為微生物代謝提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因此，加入發(fā)酵菌的兩個(gè)組中，經(jīng)過(guò)滅菌處理的干物質(zhì)回收率、粗蛋白含量與未滅菌的差異不顯著（P＞0.05）。由此可見(jiàn)，對(duì)于刺參發(fā)酵飼料而言，其飼料原料的殺菌預(yù)處理對(duì)發(fā)酵菌的增殖影響不大，從經(jīng)濟(jì)和實(shí)用角度出發(fā)，在后期發(fā)酵飼料規(guī)?；苽溥^(guò)程中，可以使用飼料原料直接進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，而無(wú)需進(jìn)行原料滅菌預(yù)處理。

3.2 發(fā)酵處理對(duì)飼料發(fā)酵效果的影響

飼料中的一些成分在發(fā)酵過(guò)程中隨著微生物的生長(zhǎng)代謝被消耗，產(chǎn)生氣體被排出，從而使飼料的干物質(zhì)含量降低[37]。因此，試驗(yàn)結(jié)束后飼料的干物質(zhì)含量有所降低，導(dǎo)致干物質(zhì)回收率低于100%。另外，飼料在微生物的代謝作用下使得添加發(fā)酵菌組的粗蛋白含量顯著高于未添加發(fā)酵菌的（P＜0.05），一定程度上提高了飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。在蘋(píng)果渣[38]、花生粕[39]、海帶[40]等的發(fā)酵中，發(fā)酵底物的粗蛋白含量均得到明顯提高，與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。水產(chǎn)飼料原料經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵處理后，其中的蛋白含量得到明顯提高[41]，能夠替代或部分替代魚(yú)粉，從而減少養(yǎng)殖中對(duì)魚(yú)粉的依賴(lài)，降低養(yǎng)殖成本。

在發(fā)酵過(guò)程中，酵母通過(guò)自身的生長(zhǎng)代謝能夠產(chǎn)生芳香類(lèi)物質(zhì)，有助于改善飼料的風(fēng)味[42]。發(fā)酵的同時(shí)，飼料的顏色、黏度等也會(huì)有一定的改變[28]。本試驗(yàn)中，添加發(fā)酵菌的兩個(gè)飼料組在發(fā)酵結(jié)束后，飼料的顏色、氣味都明顯優(yōu)于未添加的。

3.3 發(fā)酵飼料對(duì)稚參生長(zhǎng)的影響

飼料經(jīng)過(guò)發(fā)酵處理可以一定程度的改善飼料的風(fēng)味，從而提高攝食量；同時(shí)還可以提高飼料的粗蛋白含量，將大分子有機(jī)物部分降解為易被吸收消化的小分子物質(zhì)，使飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到提高。因此，在稚參的投喂試驗(yàn)中可以看出，投喂發(fā)酵飼料的稚參增重率和特定生長(zhǎng)率分別為（26.14±0.18）%、（2.11±0.04）%/d，均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。兩種飼料對(duì)養(yǎng)殖刺參健康狀況的影響主要表現(xiàn)在腸道充盈度方面，說(shuō)明刺參對(duì)發(fā)酵飼料的攝食、消化性能優(yōu)于未發(fā)酵的飼料。魏金濤等[43]在發(fā)酵飼料喂養(yǎng)斷奶仔豬的研究中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵飼料能夠提高仔豬的日增重，同時(shí)飼料經(jīng)過(guò)發(fā)酵處理后其營(yíng)養(yǎng)成分的表觀消化率得到明顯提高?？梢?jiàn)，發(fā)酵飼料在提高仔豬生長(zhǎng)性能方面起到了重要作用[44-46]。另有研究指出，發(fā)酵飼料能夠改善奶牛的體況，提高產(chǎn)奶量，同時(shí)還能緩解奶牛在泌乳中后期產(chǎn)奶量大幅下降的情況[19，47-48]，提高經(jīng)濟(jì)效益。水產(chǎn)養(yǎng)殖中，采用發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉的應(yīng)用已比較普遍，替代后能夠提高養(yǎng)殖動(dòng)物的特定生長(zhǎng)率，一定程度改善飼料的利用率[49-50]。

4 結(jié)論

①通過(guò)對(duì)發(fā)酵飼料各評(píng)價(jià)指標(biāo)的對(duì)比分析可以看出，消毒滅菌處理對(duì)飼料發(fā)酵效果的影響不明顯，考慮到生產(chǎn)成本問(wèn)題，在本試驗(yàn)條件下無(wú)需對(duì)原料進(jìn)行消毒滅菌處理。

②與未發(fā)酵飼料相比，發(fā)酵飼料能夠明顯促進(jìn)稚參健康、快速生長(zhǎng)。