■ 王國霞 曹俊明 牛鳳池 黃文慶 胡俊茹 陳 冰 范怡杰 黃燕華 *

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，廣東廣州510640；2.廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640；3.廣東省動(dòng)物育種與營養(yǎng)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640；4.廣州飛禧特水產(chǎn)科技有限公司，廣東廣州510640）

腸道是動(dòng)物吸收營養(yǎng)物質(zhì)的重要場所，同時(shí)又是機(jī)體最大的微生態(tài)系統(tǒng)，腸道受損會(huì)導(dǎo)致機(jī)體病態(tài)，影響營養(yǎng)物質(zhì)消化利用，影響動(dòng)物生長。宋霖等[1]研究發(fā)現(xiàn)黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）腸道對飼料植物蛋白豆粕、菜粕和花生粕添加量很敏感，過多對腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)有負(fù)面影響。陳燕[2]研究發(fā)現(xiàn)，配方中增加植物性蛋白源使用會(huì)導(dǎo)致黃顙魚腸道組織結(jié)構(gòu)形態(tài)損傷，甚至發(fā)生病理變化而影響生長。而魚粉的緊缺及價(jià)格上漲使得黃顙魚配方中不得不多用植物蛋白原料。植物蛋白源存在一些抗?fàn)I養(yǎng)因子如植酸鹽和大豆抗原蛋白，植酸鹽不能很好的被魚類消化利用[3-4]，同時(shí)對蛋白的消化[5]和礦物的利用率有負(fù)面影響[6-8]。目前，在配合飼料中添加酶制劑，成為解決植物性原料抗?fàn)I養(yǎng)因子進(jìn)而改善腸道健康的有效途徑之一。大豆抗原蛋白對養(yǎng)殖動(dòng)物具有免疫原性，過多攝入會(huì)影響腸道的發(fā)育，降低腸道消化及免疫能力。據(jù)報(bào)道，在蛋雞飼料[9-10]中添加植酸酶能提高腸絨毛高度，改善腸道健康狀況，也有植酸酶[11]和復(fù)合酶[12]在肉雞中有改善腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的類似報(bào)道。酶制劑對魚類腸道組織影響的研究報(bào)道相對較少，如在虹鱒中添加外源蛋白酶可以提高腸道皺襞高度、面積，進(jìn)而改善腸道健康[13]。已有在黃顙魚飼料中添加植酸酶[14-15]提高生長、消化率等，及復(fù)合酶[16-17]促生長的報(bào)道，且飼料轉(zhuǎn)化率偏低，也沒有對腸道組織影響的指標(biāo)。為此，本試驗(yàn)對飼料配方進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，國產(chǎn)魚粉用量為26%，蛋白源主要為植物性原料進(jìn)行配制，研究植酸酶和該復(fù)合酶對黃顙魚血清免疫抗氧化指標(biāo)和腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，同時(shí)對比兩種酶的效果，為植酸酶和復(fù)合酶在黃顙魚飼料中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以含26%魚粉、32%豆粕、10%棉粕和10%雙低菜粕等的黃顙魚實(shí)用飼料為基礎(chǔ)飼料，原料組成和營養(yǎng)水平見表1。在基礎(chǔ)飼料中分別添加1 000 IU/kg植酸酶、400 mg/kg復(fù)合酶制劑配制2種試驗(yàn)飼料。原料粉碎后過40目篩，按配方準(zhǔn)確稱量原料逐級(jí)混勻，通過SLX-80型雙螺桿擠壓機(jī)制成1.5 mm的顆粒飼料，55℃下烘干，自然冷卻后置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。植酸酶? 000 U/g）由廣東溢多利生物科技股份有限公司提供；復(fù)合酶制劑（蛋白酶2 200 U/g、淀粉酶4 000 U/g、纖維素酶20 U/g、脂肪酶14 U/g、果膠酶180 U/g）由某知名企業(yè)提供。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 樣品采集及測定

飼養(yǎng)試驗(yàn)在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所水產(chǎn)研究室室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行，水體體積約為300 L。選取（1.02±0.01）g健康的黃顙魚360尾，隨機(jī)分成3組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾魚，分別投喂基礎(chǔ)飼料和2種添加飼料，記作對照組、植酸酶組和復(fù)合酶組。正常養(yǎng)殖56 d。養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后停食24 h，每缸隨機(jī)取8尾魚，用1 ml無菌注射器于尾靜脈取血，常溫下靜置4 h后用離心機(jī)于4℃3 500 r/min離心10 min，取上清液分裝后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。免疫、抗氧化指?biāo)采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測定，方法參照說明書進(jìn)行。采血后每缸隨機(jī)取2尾魚解剖取胃部后端膨大處1 cm的前腸，放入福爾馬林固定液中保存，制備石蠟組織切片，HE染色光鏡觀察，運(yùn)用Image-Pro Plus進(jìn)行腸道組織學(xué)測量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），若差異顯著則對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan's法多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 黃顙魚血清免疫抗氧化指標(biāo)（見表2）

表2 外源酶制劑對黃顙魚免疫和抗氧化指標(biāo)的影響

表2 （續(xù)） 外源酶制劑對黃顙魚免疫和抗氧化指標(biāo)的影響

由表2可知，各組酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、過氧化氫酶及抗超氧陰離子自由基含量無顯著差異（P＞0.05）；與對照組比較，試驗(yàn)組超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、總抗氧化能力（T-AOC）均有升高，其中SOD分別提高了17.81%、12.99%，植酸酶組T-AOC提高14.92%，但差異不顯著（P＞0.05）；試驗(yàn)組丙二醛含量較對照組有所下降，其中復(fù)合酶組下降幅度達(dá)到17.88%，但差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 黃顙魚前腸形態(tài)和結(jié)構(gòu)

各組黃顙魚的前腸形態(tài)結(jié)果如圖1～圖3所示。對照組黃顙魚前腸肌肉層較薄，褶皺數(shù)量及高度均較小，褶皺斷裂現(xiàn)象明顯；植酸酶組和復(fù)合酶組肌肉層較厚，褶皺數(shù)量增多，高度增加，排列整齊，斷裂較少。

外源酶制劑對黃顙魚前腸組織結(jié)構(gòu)的影響見表3。由表3可知，試驗(yàn)組黃顙魚前腸腸壁厚度和腸絨毛高度均高于對照組，植酸酶組分別提高了2.27%、3.76%，復(fù)合酶組分別提高了16.28%、15.22%，但差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 對照組前腸組織結(jié)構(gòu)（HE）

圖2 植酸酶組前腸組織結(jié)構(gòu)（HE）

圖3 復(fù)合酶組前腸組織結(jié)構(gòu)（HE）

表3 外源酶制劑對黃顙魚前腸組織結(jié)構(gòu)的影響（μm）

3 討論

3.1 對黃顙魚血清免疫、抗氧化指標(biāo)的影響

SOD能夠催化超氧化物歧化為氧氣和過氧化氫，屬于金屬酶，是一種活性氧清除劑，在防止生物大分子氧化損傷方面具有重要作用。它可以將超氧陰離子（O2-·）歧化為過氧化氫（H2O2）和氧氣（O2），從而避免自由基對機(jī)體造成的氧化損傷[18]。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)重要的過氧化物分解酶，催化還原型谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應(yīng)，防止細(xì)胞膜氧化。T-AOC的大小既可以反映機(jī)體清除氧自由基的能力，也反映了機(jī)體對外來刺激的代償能力。MDA作為脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性，含量的多少可反映脂質(zhì)氧化及細(xì)胞受損情況。通常將SOD和MDA測定相互配合，共同評價(jià)機(jī)體抗氧化能力強(qiáng)弱。Zhu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，植酸酶添加于黃顙魚幼魚飼料（低魚粉10%和低蛋白30%）中可通過提高其血液中ROS、SOD和CAT含量進(jìn)而提高抗氧化力，但對血清AKP沒有影響。馬恒甲等[19]報(bào)道，在草魚全植物蛋白飼料中添加植酸酶為1 000～1 250 U/kg時(shí)有助于草魚的非特異性免疫機(jī)能的提高，在建鯉飼料中添加2 500 IU/kg植酸酶后，血清中溶菌酶、酸性磷酸酶顯著提高[20]。而在1～4周齡五龍鵝飼糧中添加植酸酶可以提高血清中T-AOC和AKP活力，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力和免疫力[21]。本試驗(yàn)中添加植酸酶對AKP、SOD、GSHPx、T-AOC有一定程度提高，且丙二醛含量下降，與上述報(bào)道不太一致，即添加植酸酶改善或提高機(jī)體抗氧化能力和免疫力的效果在不同動(dòng)物或同一動(dòng)物不同配方中不同，目前相關(guān)報(bào)道較少，有待更多研究。

戚傳利等[22]報(bào)道，飼料中添加復(fù)合酶顯著提高了刺參體腔液的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、溶菌酶（LZM）和堿性磷酸酶（AKP）活性。在草魚幼魚飼料中添加以木聚糖酶、β-葡聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶為主的600、900 mg/kg復(fù)合酶制劑可以顯著提高血液中白細(xì)胞的吞噬活性、血清殺菌能力[23]。王國霞等[17]在黃顙魚低魚粉（5%）飼料中添加100～200 mg/kg復(fù)合酶制劑時(shí)血清LZM活性顯著升高。這與鐘國防等[24]和謝駿等[25]對奧尼羅非魚的研究和黃峰等[26]對異育銀鯽的研究結(jié)果一致。以上報(bào)道說明復(fù)合酶能提高魚體的體液免疫因子，進(jìn)而提高其抗氧化力或免疫力。而本試驗(yàn)中添加復(fù)合酶對黃顙魚血清SOD、GSH-Px、T-AOC有一定程度提高，對免疫指標(biāo)ACP和AKP沒有影響，與已有報(bào)道不太一致，分析跟飼料配方、復(fù)合酶種類配比及使用劑量有關(guān)。

3.2 對黃顙魚前腸組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)的影響

腸道是機(jī)體重要的消化器官，也是機(jī)體最大的微生態(tài)系統(tǒng)，同時(shí)兼有免疫、排毒等功能，維持魚體腸道良好的消化吸收功能，對于魚體的快速生長及抵御病害均有重要的作用。研究表明，在蛋雞[9-10]和肉雞[11]飼糧中添加植酸酶能夠促進(jìn)腸道發(fā)育和改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，飼料中添加植酸酶可以增加花鱸前腸肌肉層厚度、絨毛高度和密度，增加固有層和上皮細(xì)胞間的緊密度[27]。本試驗(yàn)中，添加1 000 IU/kg的植酸酶后，黃顙魚腸壁厚度及腸絨毛高度均有所提高，但差異不顯著，與上述研究相似。分析是植物蛋白源中含有植酸，與營養(yǎng)物質(zhì)絡(luò)合影響魚體消化吸收，導(dǎo)致腸道營養(yǎng)供應(yīng)不足，影響腸道健康，植酸酶通過分解植酸釋放營養(yǎng)物質(zhì)，改善腸道營養(yǎng)狀況進(jìn)而改善腸道形態(tài)。

飼料中植物蛋白源含量過高時(shí)會(huì)對魚體腸道造成損傷，魚體腸道受損情況通常與植物蛋白源的種類及含量相關(guān)，魚體消化器官受損可能與植物蛋白源中蛋白酶抑制因子和皂莢等有關(guān)[28]。張偉[29]研究發(fā)現(xiàn)，大豆皂甙可造成異育銀鯽腸道結(jié)構(gòu)發(fā)生病理性變化，如黏膜皺襞變短、肌層變薄、上皮細(xì)胞排列紊亂等。Buttle等[30]也報(bào)道，在大西洋鮭和虹鱒飼料中添加高水平豆粕時(shí)，因?yàn)榇蠖鼓卦隗w內(nèi)與腸上皮細(xì)胞結(jié)合，導(dǎo)致其腸道受損。張娟娟等[13]報(bào)道，在虹鱒中添加外源蛋白酶可以提高腸道皺襞高度、面積進(jìn)而改善腸道健康。本試驗(yàn)中，復(fù)合酶制劑組黃顙魚腸道腸絨毛高度和腸壁厚度均高于對照組，雖未達(dá)到顯著水平，但也說明復(fù)合酶制劑的添加對黃顙魚腸道形態(tài)有所改善，結(jié)果與之類似。本試驗(yàn)所用配方中植物蛋白原料高達(dá)52%，植物蛋白源中含有抗?fàn)I養(yǎng)因子，影響黃顙魚消化吸收，且對腸道造成一定影響，該復(fù)合酶制劑含有蛋白酶、淀粉酶等，可消除部分抗?fàn)I養(yǎng)因子對腸道造成的不良影響，增加消化酶分泌進(jìn)而提高其活性，使腸道營養(yǎng)物質(zhì)更加均衡，調(diào)節(jié)腸道微生物進(jìn)而改善腸道形態(tài)。

4 結(jié)論

在黃顙魚實(shí)用飼料中分別添加植酸酶和復(fù)合酶能一定程度提高血清SOD、GSH-Px、T-AOC和降低MDA含量而改善魚體抗氧化力；同時(shí)能夠增加黃顙魚腸道腸壁厚度，提高腸絨毛高度，改善魚體腸道健康。