■ 苗華彪 韓楠玉 ，2，3，4 李國濤 唐湘華 ，2，3，4 黃遵錫 ，2，3，4*

(1.云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650500；2.生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心，云南昆明 650500；3.云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650500；4.云南師范大學(xué)酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650500)

優(yōu)良的酶制劑除了在飼料工業(yè)和養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)上有較大規(guī)模的應(yīng)用，在節(jié)約糧食和環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展方面也有突出的貢獻(xiàn)。目前，酶制劑的開發(fā)與推廣已經(jīng)成為生物產(chǎn)業(yè)中的重要課題[1]。研究表明，外源酶制劑的添加不僅不會(huì)對畜禽內(nèi)源性酶造成影響，還能加快營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，并提高飼料原料的營養(yǎng)價(jià)值，達(dá)到降低飼料生產(chǎn)成本的目的[2-3]。添加到飼料中的酶制劑種類繁多，成功應(yīng)用雖然具有一定難度，但也存在巨大的開發(fā)空間。在現(xiàn)有的飼料酶制劑中，木聚糖酶和甘露聚糖酶等非淀粉多糖酶制劑已得到廣泛應(yīng)用[3-5]。木聚糖酶可對飼料中的阿拉伯木聚糖進(jìn)行有效的降解，以此消除飼料原料中抗?fàn)I養(yǎng)因子的不利效應(yīng)，從而提高原料的利用率。甘露聚糖酶可以降解多組分抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高動(dòng)物的日增長率，改善畜禽腸道中微生物菌群[6-7]。如今，酶制劑在生豬養(yǎng)殖和家禽養(yǎng)殖中都有顯著的促生長效果。因此，尋求一款穩(wěn)定性高的酶制劑是生產(chǎn)廠家和消費(fèi)者的共同訴求。眾所周知，無論是木聚糖酶還是甘露聚糖酶都會(huì)受到溫度、pH值、內(nèi)源性消化酶和其它生物大分子等諸多因素的影響[8]。不同酶制劑有不同的最適pH值環(huán)境和最適溫度，當(dāng)它們在各自的最適環(huán)境中能夠發(fā)揮最大的催化活力。就實(shí)際情況分析：家畜和家禽消化道的正常溫度約為40℃，豬胃部環(huán)境的pH值環(huán)境在2.5～3.5間，小腸pH值環(huán)境在5.0～7.0間，大腸酸堿度呈中性[9]。本研究中的木聚糖酶和甘露聚糖酶這類非淀粉多糖酶的最適pH值為5.0～7.0，主要在豬小腸液和雞消化液中發(fā)揮作用[10]。至今鮮有酶制劑在真實(shí)環(huán)境中（例如豬和家禽的消化液中）耐受情況的報(bào)道，體外的簡單環(huán)境（pH值、溫度）模擬試驗(yàn)并不能充分揭露畜禽消化道對酶制劑的真實(shí)作用。因此，我們選用豬的腸液和雞消化液耐受木聚糖酶和甘露聚糖酶，以此來研究、比較不同酶制劑在畜禽消化道中的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選中的八種不同酶制劑是選自全國各地市場在售的產(chǎn)品，其酶活性見表1。消化液取自市場流動(dòng)的生豬和菜雞（昆明）。

1.2 主要的試驗(yàn)試劑和儀器

木聚糖（Xylan from beechwood＞98%）、角豆膠(Locust bean gum from Ceratonia siliqua seeds＞98%)均購自美國Sigma公司；分析天平購自梅特勒-托利多儀器有限公司；紫外分光光度計(jì)購自德國Analytic Jena公司；酶標(biāo)儀購自Bio-Rad公司；離心機(jī)購于德國Ep?pendorf公司；恒溫水浴鍋等其他儀器均為國產(chǎn)。

表1 8種不同來源的酶制劑的命名及酶活（U/g）

1.3 豬的小腸液和雞的消化液（現(xiàn)用現(xiàn)取）

豬的小腸液取自昆明市呈貢區(qū)屠宰場，取剛剛屠宰過的生豬的小腸液500 ml立即置于冰上，然后低溫離心取上清液并測定其pH值，上清液用作處理酶制劑。購買活雞屠宰，取其腸內(nèi)消化液離心去雜質(zhì)并測定其pH值，上清液用作酶制劑處理。

1.4 酶活的測定方法

根據(jù)3,5-二硝基水楊酸(3,5-Dinitrosalicylic acid，DNS)酶活測定法：加入0.1 mol/l、pH值5.5的檸檬酸緩沖液450 ml和相同體積1%的底物，于37℃水浴鍋中預(yù)熱5 min，加入0.1 ml待測酶液，混勻反應(yīng)10 min，然后加入1.5 ml DNS停止反應(yīng)，搖勻后煮沸5 min，冷卻后于540 nm波長測定吸光度值[11]。

1.5 試驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱取一定量的四種木聚糖酶和四種甘露聚糖酶酶制劑顆粒到pH值5.5、濃度0.1 mol/l的檸檬酸-磷酸緩沖液中，放在磁力攪拌器上攪拌30 min，取0.5 ml溶解的酶液分別與9.5 ml現(xiàn)取豬腸液或雞消化液充分混合。取適量混合液在37℃處理0～5 h，以沒有處理的酶液為對照。取樣經(jīng)適當(dāng)稀釋后在37℃、pH值5.5下按照DNS法測定其酶活，以未經(jīng)處理的酶液為100%。

1.6 試驗(yàn)方法

木聚糖酶和甘露聚糖酶的最適pH值：將適當(dāng)稀釋的八種酶制劑分別于37℃下，pH值為3.0～10.0范圍環(huán)境內(nèi)進(jìn)行酶促反應(yīng)；木聚糖酶和甘露聚糖酶的最適溫度：將適當(dāng)稀釋的八種酶制劑分別于pH值5.5環(huán)境下，于30～80℃范圍內(nèi)進(jìn)行酶促反應(yīng)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 4種木聚糖酶和4種甘露聚糖酶的最適溫度

木聚糖酶、甘露聚糖酶各4種最適溫度結(jié)果見圖1。本試驗(yàn)所選擇的木聚糖酶和甘露聚糖酶最適溫度分布在50～65℃，其中4種木聚糖酶最適溫度分別為：65、60、55℃以及 65℃；4種甘露聚糖酶最適溫度前三種為60℃，4號(hào)甘露聚糖酶為50℃。并且8種酶制劑都具有較寬的溫度范圍。

圖1 四種木聚糖酶和甘露聚糖酶的最適溫度

2.2 4種木聚糖酶和4種甘露聚糖酶的最適pH值

木聚糖酶、甘露聚糖酶各4種的最適pH值結(jié)果見圖2。所選用的木聚糖酶和甘露聚糖酶的最適pH值分布在5.0～6.0，為中性偏酸酶制劑，并且在pH值4.0～8.0時(shí)具有良好的pH穩(wěn)定性。

2.3 豬的小腸液對木聚糖酶和甘露聚糖酶酶活的影響

圖2 四種木聚糖酶和甘露聚糖酶的最適pH值

豬的小腸液對木聚糖酶、甘露聚糖酶最長耐受4 h結(jié)果見圖3。四種木聚糖酶在37℃處理4 h后相對酶活剩余均在48%～60%之間，相對而言其中2號(hào)木聚糖酶的穩(wěn)定性最好，4 h耐受后剩余酶活仍接近60%，3號(hào)木聚糖酶和4號(hào)木聚糖酶次之，4 h后分別剩余55%和53%的酶活，而1號(hào)木聚糖酶耐受相對效果最差，4 h后已降到50%以下，僅剩余48%的酶活。類似的，四種甘露聚糖酶在37℃處理4 h后，2號(hào)甘露聚糖酶穩(wěn)定性最好，剩余65%的酶活；4號(hào)甘露聚糖酶表現(xiàn)最差，相對剩余酶活僅為10%；而1號(hào)和3號(hào)甘露聚糖酶4 h后相對剩余酶活分別為48%和58%。

2.4 雞的消化液對木聚糖酶、甘露聚糖酶酶活的影響

雞消化液對木聚糖酶和甘露聚糖酶的耐受結(jié)果見圖4，在37℃耐受5 h后兩類酶制劑的所有產(chǎn)品的相對剩余酶活都在50%以上。其中：1號(hào)木聚糖酶穩(wěn)定性效果最差，耐受5 h后，相對剩余酶活為63%；2號(hào)木聚糖酶穩(wěn)定性最好，相對剩余酶活為76%；3、4號(hào)次之相對剩余酶活分別為68%和75%。四種甘露聚糖酶在雞消化液中穩(wěn)定性表現(xiàn)為：4號(hào)甘露聚糖酶穩(wěn)定性最差，耐受5 h后相對剩余酶活為52%；2號(hào)穩(wěn)定性最好，5 h后相對剩余酶活為67%；1、3號(hào)次之，5 h后其相對剩余酶活分別為56%和65%。

圖3 4 h內(nèi)豬小腸液對四種木聚糖酶和甘露聚糖酶酶活的影響（37℃）

圖4 5 h內(nèi)雞消化液對四種木聚糖酶和甘露聚糖酶酶活的影響（37℃）

3 討論

飼用酶制劑作為一種生物催化活性蛋白，具有酶的所有特征。雖然具較高活性，然而在不同的畜禽體內(nèi)環(huán)境中，活性也會(huì)受到pH值、溫度以及體內(nèi)外其它離子和蛋白的影響[12]。只有當(dāng)酶制劑的酶學(xué)性質(zhì)（如最適溫度、最適pH值以及體外環(huán)境等）與動(dòng)物胃腸道生理特點(diǎn)相吻合時(shí)，才能充分發(fā)揮其催化活性，催化效率才能達(dá)到最大[13]。一般來講，胃腸道中酶解作用的環(huán)境條件（如pH值、底物濃度及內(nèi)源性蛋白酶等）均不斷發(fā)生變化，豬胃液呈偏酸性環(huán)境，而后段腸液呈偏中性的環(huán)境；雞的消化液的環(huán)境介于pH值4～7之間，呈酸性[14-15]。同理，酶制劑受溫度的影響也比較大，選擇適宜的測定溫度也是必要的。在選擇體外評估酶制劑的生物學(xué)功效時(shí)，其所選的處理溫度應(yīng)接近動(dòng)物的體溫37～42℃，因此，本試驗(yàn)選擇在37℃的溫度條件下進(jìn)行。

豬小腸液和雞消化液環(huán)境相對胃液pH值有著明顯升高可到6.0～7.0左右，并且具有大量的內(nèi)源性蛋白酶（胰蛋白酶、糜蛋白酶等酶）以及膽汁[16]。而大多數(shù)木聚糖酶和甘露聚糖酶其最適pH值介于微酸附近，腸液的酸堿環(huán)境剛好適合木聚糖酶和甘露聚糖酶的發(fā)揮，因此本試驗(yàn)選用腸液作為穩(wěn)定性研究對象。兩類酶制劑的穩(wěn)定性在豬小腸液處理4 h后，相對剩余酶活具有很大差距：四種不同來源的木聚糖酶有40%～52%的下降；四種甘露聚糖酶有著35%～90%不等的下降。兩類酶制劑在雞消化液中處理5 h后，木聚糖酶的相對剩余酶活有24%～37%的下降，四種甘露聚糖酶有33%～48%不同程度的下降。腸道作為一個(gè)復(fù)雜的生物催化的場所，有各種因素影響酶促反應(yīng)。本研究所選用的豬小腸液和雞消化液環(huán)境的pH值分別為6.6和6.4，溫度為37℃，雖與兩類酶制劑的最適pH值環(huán)境及最適溫度接近，然而其它的復(fù)雜生物因子仍然影響著酶制劑的酶活，例如內(nèi)源蛋白酶和膽汁液等對所選酶制劑的分解作用使其酶活力下降[17]。因此，在此真實(shí)的消化液環(huán)境條件下耐受4 h和5 h后甘露聚糖酶和木聚糖酶的酶活有所下降是必然的；而不同種類的酶制劑受環(huán)境的影響也有差別，在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)甘露聚糖酶制劑相比于木聚糖類酶制劑的耐受效果要差一些。

另一方面，對于來源相同的酶制劑在豬和雞兩種動(dòng)物消化液的穩(wěn)定性結(jié)果也不盡相同，相同來源的酶制劑的穩(wěn)定性結(jié)果展現(xiàn)為：無論木聚糖酶還是甘露聚糖酶，在雞腸道消化液中穩(wěn)定性要好于在豬腸道小腸液。分析其可能原因?yàn)?，不同種屬動(dòng)物及其發(fā)育成熟過程中，腸道黏膜細(xì)胞膜表面蛋白質(zhì)所含糖鏈及糖基化模式有所不同，鳥類較豬代謝和消化較快，與腸道消化液中化學(xué)性消化較弱有關(guān)[18]。同時(shí)本研究還表明不同來源的酶制劑在豬和雞腸道內(nèi)的穩(wěn)定性與酶活力并無直接關(guān)聯(lián)，無論木聚糖酶還是甘露聚糖酶在豬小腸液或者雞腸道消化液中的穩(wěn)定性和生產(chǎn)酶活不成正比關(guān)系。

豬小腸液和雞消化液中環(huán)境的變化，嚴(yán)重影響了酶制劑的活性，不同廠家之間也會(huì)有著一定的差異。在本試驗(yàn)中，不論在豬小腸液或雞的腸道消化液中：四種木聚糖酶制劑，2號(hào)耐受效果最好，1號(hào)最差，3號(hào)、4號(hào)次之；四種甘露聚糖酶制劑，2號(hào)耐受效果最好，4號(hào)最差，1號(hào)、3號(hào)次之。因此，我們選用酶制劑時(shí)，要選用在實(shí)際畜禽胃腸液中耐受效果好、保留時(shí)間長、相對剩余酶活高的酶制劑。確保酶制劑在畜禽消化道中能夠真正發(fā)揮其生物學(xué)功效，使底物有效的降解，改善畜禽對外來營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收，這樣才能更好的發(fā)揮酶制劑的作用，帶來更高的效益。

4 結(jié)論

在豬小腸液和雞腸道消化液中穩(wěn)定性最好的木聚糖酶和甘露聚糖酶分別是2號(hào)木聚糖酶、2號(hào)甘露聚糖酶，最差的是1號(hào)木聚糖酶和4號(hào)甘露聚糖酶。不同來源的酶制劑在豬小腸液和雞腸道消化液的穩(wěn)定性具有一致性，相對于豬小腸液，酶制劑在雞腸道消化液中更加穩(wěn)定。同時(shí)，酶制劑在畜禽腸道消化液中穩(wěn)定性和生產(chǎn)酶活力并不成正比關(guān)系。