溫 蓓，何 剛

四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院.四川省人民醫(yī)院 耳鼻喉科 (成都 610072)

·論 著·

FBXL20在喉癌組織中的表達(dá)及意義

溫 蓓，何 剛△

四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院.四川省人民醫(yī)院 耳鼻喉科 (成都 610072)

目的 檢測喉癌組織中FBXL20的表達(dá)，并探討其與喉癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系以及臨床應(yīng)用的潛在價(jià)值。方法 用免疫組化SP法，檢測30例喉癌組織和其對(duì)應(yīng)的正常組織中FBXL20的表達(dá)情況。結(jié)果 FBXL20表達(dá)于正常組織和腫瘤組織的胞漿中，相對(duì)于腫瘤組織，F(xiàn)BXL20在正常組織中表達(dá)較高(P=0.010)；其表達(dá)在有無侵犯淋巴結(jié)中，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.042)；其表達(dá)在正常組織與低分化腫瘤中，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018)。結(jié)論 FBXL20在喉癌的發(fā)生中可能發(fā)揮著一定作用，并且可能是喉癌發(fā)生過程中的抑制因子。

喉癌；FBXL20；免疫組化

喉癌是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐年上升[1],在全世界常見的頭頸部腫瘤中，位居第2，約占全世界所有腫瘤的1%～5%，并且常見于成年男性，在男性中發(fā)病率約為5.1/100 000[2]。喉癌的主要病理類型為鱗狀細(xì)胞癌，約占所有喉癌的95%～98%[3]。 雖然喉癌的原因尚不明確，但普遍認(rèn)為，這種癌癥是由多種因素聯(lián)合作用的結(jié)果，主要是環(huán)境和遺傳因素[4]。流行病學(xué)研究[5]表明，吸煙和飲酒在喉癌的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。另外，研究喉癌相關(guān)的遺傳因素，從分子遺傳學(xué)的角度研究可能與喉癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)分子，并通過相關(guān)性分析篩選可能的易感基因，在喉癌的發(fā)病機(jī)制研究中具有重要意義。

研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BP家族的高表達(dá)與多種人類惡性腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)，如肺癌、腎癌、食管癌和結(jié)腸癌。FBXL20作為FBP家族的成員，其在結(jié)直腸腺癌中表達(dá)水平高于正常組織，并且可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。同時(shí)，也有報(bào)道[8-9]顯示，F(xiàn)BXL20與多種分子相關(guān)，并可能通過調(diào)節(jié)其相關(guān)分子發(fā)揮作用。盡管FBXL20 在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌和睪丸癌等眾多腫瘤中均有表達(dá)[7]，但其是否在喉癌中有表達(dá)，以及其表達(dá)高低與喉癌臨床病理特征之間是否相關(guān)，至今很少研究。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

30例喉癌標(biāo)本和其相對(duì)應(yīng)的正常組織取自于2012～2016年所有四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院.四川省人民醫(yī)院的住院病人，30例喉癌病人一般資料如下(表1)。喉癌組織經(jīng)病理檢查均為鱗狀細(xì)胞癌，其對(duì)應(yīng)的正常組織經(jīng)病理檢查無癌組織。FBXL20兔抗人多克隆抗體(購于美國ABCAM公司)，SP免疫組化染色試劑盒和液體DAB酶底物顯色試劑盒(購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

表1 30例喉癌病人的一般資料

1.2 免疫組化(SP法)

1.2.1 石蠟切片和SP法步驟 包埋好的石蠟切片常規(guī)切片4 μm,每例正常組織和腫瘤組織各切片5張：空白對(duì)照1張，HE染色1張，另外3張行FBXL20 SP法染色。石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟2次( 10 min/次)后，梯度酒精水化(5 min/次)，然后3%過氧化氫10 min去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，水浴鍋加熱0.01 mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH6.0)至95 ℃左右，放入組織切片加熱10～15 min, 磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗兩次，5 min/次(0.01 M PBS，pH7.4)，37 ℃,山羊血清工作液孵育25 min。隨后，滴加適當(dāng)比例稀釋的FBXL20抗體(1∶400，稀釋液為磷酸鹽緩沖液),4 ℃過夜。復(fù)溫后，滴加生物素化二抗工作液,37 ℃,孵育1 h, 然后滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 ℃,孵育40 min。DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色合適后,自來水終止顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，自來水沖洗后梯度酒精脫水，二甲苯透明后中性樹膠封閉?？瞻讓?duì)照組與實(shí)驗(yàn)組步驟相同，只是FBXL20抗體用PBS代替。而HE染色是經(jīng)過二甲苯脫蠟，酒精梯度脫水，蘇木素染色，鹽酸酒精分化，伊紅染色，自來水返藍(lán)后,再經(jīng)過梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封閉。

1.2.2 免疫組化結(jié)果觀察 以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以已知的陽性組織作為陽性對(duì)照。FBXL20陽性判定：染色陽性以細(xì)胞漿呈現(xiàn)棕黃染色為標(biāo)準(zhǔn)，每張切片選擇有代表性的區(qū)域，在100倍視野下進(jìn)行計(jì)數(shù)，共計(jì)5個(gè)視野，取其平均值，避免隨意性。FBXL20 的光密度(OD)值用圖像分析軟件Image ProPlus 進(jìn)行分析，F(xiàn)BXL20表達(dá)強(qiáng)弱參考張鳴號(hào)等[10]報(bào)道的方法，根據(jù)染色的強(qiáng)度及陽性細(xì)胞的面積判斷結(jié)果。每張切片陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度按無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別計(jì)分為0、1、2、3分；按陽性細(xì)胞面積分別計(jì)分為0(0%)、1(1%～25%)、2(26%～50%)、3(51%～75%)、4(76%～100%)分。根據(jù)兩項(xiàng)打分乘積判斷結(jié)果：0分為陰性(-)，≤3分為陽性(+)，3～6分為中度陽性(++)，≥6分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

根據(jù)免疫組化結(jié)果，F(xiàn)BXL20在腫瘤組織和正常組織中都有表達(dá)，且多在胞漿中表達(dá)。在正常組織中，F(xiàn)BXL20的平均OD值為(0.199±0.091)，在腫瘤組織中為(0.162±0.072)。相對(duì)于正常組織來講，F(xiàn)BXL20在腫瘤組織中表達(dá)下降(P=0.010)。同時(shí)，也分析了FBXL20的表達(dá)與臨床病理參數(shù)如年齡、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度之間的關(guān)系。在年齡中，≤60歲患者腫瘤組織FBXL20的平均OD值為(0.177±0.069)，而在>60歲患者腫瘤組織中為(0.149±0.075)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.309)。在分化程度中，高分化患者腫瘤組織FBXL20平均OD值為(0.176±0.059)，與正常組織中FBXL20的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.364)；中分化患者腫瘤組織FBXL20平均OD值為(0.171±0.070)，與正常組織中FBXL20的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.413)；低分化患者腫瘤組織FBXL20的平均OD值為(0.091±0.078)，與正常組織中FBXL20 的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018)。在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，腫瘤組織中FBXL20的平均OD值為(0.153±0.069)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者腫瘤組織FBXL20的平均OD值為(0.165±0.077)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.042)(表2)。

表2 FBXL20的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系±s)

3 討論

浸潤與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要特征，也是決定患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。有學(xué)者[11]提出了惡性腫瘤浸潤的三步學(xué)說，即黏附、降解和移動(dòng)。 喉癌是高侵襲性的惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多基因、多階段的演進(jìn)過程[12]。

在已發(fā)現(xiàn)的FBP家族的100多個(gè)蛋白中， β-Trcp、 Skp2和Fbw7具有匹配下游底物特征的組件[9]，F(xiàn)-box其他蛋白在不同疾病中發(fā)揮著作用,例如：FBXO3在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的增生滑膜中表達(dá)上調(diào)，當(dāng)肌肉萎縮時(shí)，F(xiàn)BXO32表達(dá)上調(diào)[13]。FBXL20，作為FBP家族的一員，定位于17q12,全長10 381 bp,編碼436個(gè)氨基酸。FBXL20的表達(dá)譜分析顯示，該基因在前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌和睪丸癌等眾多惡性腫瘤中均有表達(dá)，F(xiàn)BXL20的編碼產(chǎn)物含有1個(gè)F-box的功能區(qū)[7]。

本研究中，通過SP法觀察到，在30例喉癌組織和其相對(duì)應(yīng)的正常組織中， FBXL20均有表達(dá)。在細(xì)胞水平，F(xiàn)BXL20多集中表達(dá)在胞漿中，當(dāng)FBXL20呈強(qiáng)陽性表達(dá)時(shí)，其胞核也有表達(dá)。在組織水平，F(xiàn)BXL20主要集中表達(dá)于上皮組織、平滑肌和腺管中。通過分析得知，與腫瘤組織相比，F(xiàn)BXL20蛋白在正常組織中表達(dá)較高，意味著FBXL20表達(dá)水平的降低可能在喉癌的發(fā)生中有一定作用。FBXL20的表達(dá)與喉癌的低分化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與高分化和中分化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但FBXL20蛋白的OD值隨著喉癌惡性程度的升高而逐漸下降，表明FBXL20的降低可能與腫瘤的發(fā)展有關(guān)。本研究觀察到，F(xiàn)BXL20的表達(dá)與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例相比，F(xiàn)BXL20在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中表達(dá)較低，預(yù)示著FBXL20蛋白表達(dá)水平的降低可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。喉癌好發(fā)于男性，本研究30例病例中，男29例，女1例，故無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

綜上所述，F(xiàn)BXL20蛋白表達(dá)水平的降低在喉癌的發(fā)生中可能發(fā)揮著一定作用，F(xiàn)BXL20可能是喉癌潛在的抑癌因子。

[1]Yu P J, Chen W G, Feng Q L,etal. Association between CYP1B1 gene polymorphisms and risk factors and susceptibility to laryngeal cancer [J]. Med Sci Monit, 2015, 21: 239-245.

[2]Wei X, He J, Wang J,etal. Bmi-1 is essential for the oncogenic potential in CD133(+) human laryngeal cancer cells [J]. Tumour Biol, 2015, 36(11): 8931-8942.

[3]Rudolph E, Dyckhoff G, Becher H,etal. Effects of tumour stage, comorbidity and therapy on survival of laryngeal cancer patients: a systematic review and a meta-analysis[J]. Eur Arch Otorhinolaryngol, 2011, 268(2): 165-179.

[4]Burduk P K. Association between infection of virulence cagA gene Helicobacter pylori and laryngeal squamous cell carcinoma [J]. Med Sci Monit, 2013, 19: 584-591.

[5]Bhattacharyya S, Mandal S, Banerjee S,etal. Cannabis smoke can be a major risk factor for early-age laryngeal cancer--a molecular signaling-based approach [J]. Tumour Biol, 2015, 36(8): 6029-6036.

[6]Kudo Y, Guardavaccaro D, Santamaria P G,etal. Role of F-box protein betaTrcp1 in mammary gland development and tumorigenesis [J]. Mol Cell Biol, 2004, 24(18): 8184-8194.

[7]牛靜靜, 苗風(fēng)濟(jì). siRNA靶向沉默fbxl20基因?qū)Ω伟㏒MMC-7721細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[J]. 川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2012, 27(3): 221-225.

[8]Xiao J, Zhang T, Xu D,etal. FBXL20-mediated Vps34 ubiquitination as a p53 controlled checkpoint in regulating autophagy and receptor degradation [J]. Genes Dev, 2015, 29(2): 184-196.

[9]Zhu J, Li K, Dong L,etal. Role of FBXL20 in human colorectal adenocarcinoma [J]. Oncol Rep, 2012, 28(6): 2290-2298.

[10] 張鳴號(hào), 彭亮,曹軍. 顯微圖像分析法與人工計(jì)數(shù)法在免疫組化結(jié)果判讀中的應(yīng)用[J]. 寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 31(2): 261-262.

[11] Watanabe T, Okano M, Hattori H,etal. Roles of FcgammaRIIB in nasal eosinophilia and IgE production in murine allergic rhinitis [J]. Am J Respir Crit Care Med, 2004, 169(1): 105-112.

[12] 劉麗庭, 劉丹, 郭其云, 等. KAI-1和CD44v3在喉癌組織中的表達(dá)及其相關(guān)性研究 [J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合耳鼻咽喉科雜志, 2014, 22(2): 88-90,94.

[13] Jin J, Cardozo T, Lovering R C,etal. Systematic analysis and nomenclature of mammalian F-box proteins[J]. Genes Dev, 2004, 18(21): 2573-2580.

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20161207.1049.008.html

doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.06.016

The Expression and Significance of FBXL20 in Laryngeal Carcinoma Tissues

WenBei,HeGang△.

SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu610072,China

Objective To detect the expression of FBXL20 in laryngeal carcinoma tissues, analyze the correlation of the expression level of FBXL20 with the occurrence and development of laryngeal carcinoma and its potential value of clinical application. Methods The immunohistochemical SP method was used to detect the expression levels of FBXL20 in the caner tissues and the adjacent normal tissues of 30 patients with laryngeal carcinoma respectively. Results The positive protein expression of FBXL20 was observed in the cell nucleus of both cancer tissues and normal tissues, but the expression levels of FBXL20 in normal tissues were significantly higher than in cancer tissues (P=0.010). The expression of FBXL20 was correlated with the lymph node metastasis (P=0.042) and the poorly differentiated tumors (P=0.018). Conclusion FBXL20 may play a certain role in the occurrence of laryngeal cancer, and it may be a inhibitory factor in the occurrence of laryngeal cancer.

Laryngeal carcinoma; FBXL20; Immunohistochemistry

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20161125.1109.016.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.06.015

R767

A

△通信作者：何剛，E-mail：heganghegang@live.cn