李佶操，王奉光，王 葵，張 渝，鄧 睿，盛艷梅

成都醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院(成都 610083)

·論 著·

基線等比增減設(shè)計(jì)法優(yōu)選黃芪注射液及燈盞細(xì)辛注射液治療氣虛血瘀證小鼠聯(lián)合用藥配比*

李佶操，王奉光，王 葵，張 渝，鄧 睿，盛艷梅△

成都醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院(成都 610083)

目的 考察不同配比的黃芪注射液、燈盞細(xì)辛注射液聯(lián)合使用對氣虛血瘀證小鼠凝血功能及血脂水平等的影響，優(yōu)選出最佳配比。方法 建立氣虛血瘀模型小鼠，結(jié)合基線等比增減設(shè)計(jì)法，將實(shí)驗(yàn)小鼠分成正常對照組、模型對照組及黃芪-燈盞細(xì)辛注射液(10∶0、10∶3、10∶6、10∶10、1∶10、0∶10)配比組，觀察給藥前后小鼠體征變化，并檢測小鼠凝血時(shí)間及血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C水平。結(jié)果 與模型組比較，除黃芪∶燈盞(10∶0)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，其余各配比組均能顯著延長凝血時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或0.05)；各配比組除對HDL-C無明顯影響外，均能顯著降低TG、TC、LDL-C水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或0.05)，均以黃芪∶燈盞(10∶6)組作用明顯。結(jié)論 黃芪-燈盞細(xì)辛注射液聯(lián)用能改善小鼠的氣虛血瘀癥狀，較單用效果好，最佳配比為黃芪∶燈盞(10∶6)。

黃芪注射液； 燈盞細(xì)辛注射液； 聯(lián)用； 氣虛血瘀證

缺血性腦病，中醫(yī)稱為“缺血性腦卒中”，好發(fā)于中老年人，是人類最常見的三大致死原因之一[1]。中醫(yī)認(rèn)為氣虛血瘀是缺血性腦病的主要病機(jī)，臨床常以益氣活血為其治法，將黃芪和燈盞細(xì)辛注射液聯(lián)合應(yīng)用，在改善患者神經(jīng)損傷引起的多種臨床癥狀，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)方面取得了優(yōu)于單用組或西醫(yī)對照組的療效[2-5]，但二者的最佳聯(lián)用比例尚不明確。本研究以“黃芪-燈盞細(xì)辛”合用的益氣活血作用為研究重點(diǎn)，擬建立氣虛血瘀證動(dòng)物模型，結(jié)合基線等比增減設(shè)計(jì)法研究黃芪和燈盞細(xì)辛聯(lián)用對氣虛血瘀模型小鼠的療效，并優(yōu)選出最佳配比，以期為后續(xù)研究及氣虛血瘀證缺血性腦卒中的臨床合理用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 黃芪注射液(黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20150409)，燈盞細(xì)辛注射液(云南生物谷藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20150532)；脂肪乳劑(每100 mL由豬油 20 g、膽固醇 10 g、膽鹽 2 g、吐溫-80 20 mL、1，2-丙二醇 20 mL及蒸餾水適量配制而成)。低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒(批號(hào)：20151027)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒(批號(hào)：20151027)，總膽固醇(TC)試劑盒(批號(hào)：20151026)，甘油三酯(TG)測試盒(批號(hào)：20151028)均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性ICR小鼠數(shù)只，體質(zhì)量(22±2)g，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，合格證號(hào)：SCXK[川]2013-15，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀(Biotek Powerwave XS2)、離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氣虛血瘀證模型小鼠的制備[6-8]將實(shí)驗(yàn)小鼠每晚22:00給予飼料2 g/每只/每天，上午10:00按5 mL/kg灌胃脂肪乳后，11:00左右游泳，分批置于水深約30 cm,水溫(14.0±0.5)℃水中，以木條撥打強(qiáng)迫其不斷游泳直到小鼠3～5 s無法浮出水面，將小鼠撈出，不予保溫措施及擦拭水跡，關(guān)閉門窗任其暴露于空氣中自然晾干，連續(xù)造模10 d。

1.2.2 分組與給藥 采用基線等比增減設(shè)計(jì)法[9-10]進(jìn)行動(dòng)物分組與給藥，將上述造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型對照組、試驗(yàn)組(按黃芪注射液與燈盞細(xì)辛注射液聯(lián)合用藥配比的不同共分為7組，具體配比見表1)，另設(shè)正常對照組。每組10只，藥物劑量參照臨床用藥劑量換算，給藥組按照0.3 mL/100 g相應(yīng)藥液于每晚18:00腹腔注射給予。模型對照組與正常對照組均給予相應(yīng)體積生理鹽水，連續(xù)給藥5 d。

1.3 評價(jià)指標(biāo)

1.3.1 體征觀察 觀察給藥前后各組小鼠的活動(dòng)情況、精神、毛發(fā)、糞便、舌質(zhì)、眼球顏色、尾部是否出現(xiàn)瘀點(diǎn)或瘀斑等癥狀。

1.3.2 凝血時(shí)間測定 末次給藥后采用毛細(xì)玻璃管從眼眶后靜脈叢取血，血液進(jìn)入吸管立即計(jì)時(shí)，每隔10 s折一小段，直至折斷處出現(xiàn)血絲，即記錄為凝血時(shí)間。

1.3.3 生化指標(biāo)檢測 第2天采用摘眼球取血法收集血液，離心(3 000 r/min，10 min)，保存血清備用。分別按照試劑盒說明書方法檢測TG、TC、LDL-C、HDL-C含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 體征觀察

參照任建勛等[8]的評價(jià)方法，造模成功的小鼠均存在不同程度氣虛血瘀表現(xiàn)：如精神萎靡、毛發(fā)枯黃或結(jié)穗或脫落、稀便等氣虛癥狀明顯，且伴舌質(zhì)暗淡或絳紫、尾部出現(xiàn)瘀點(diǎn)或瘀斑等血瘀表征，給藥5 d后各藥物組的氣虛血瘀癥狀均較模型組有較明顯改善。

2.2 不同給藥組小鼠凝血時(shí)間比較

末次給藥后每組隨機(jī)選取6只小鼠，采用毛細(xì)管法進(jìn)行凝血時(shí)間測定。結(jié)果顯示：模型組的凝血時(shí)間明顯低于正常組，表明該模型制備是成功的；與模型組比較，黃∶燈(10∶0)對凝血時(shí)間無明顯影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余各配比組均能明顯延長凝血時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)；與黃∶燈(10∶6)比較，各受試藥組除(10∶1)、(10∶10)組無明顯差異外，其余組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故對凝血時(shí)間的影響，尤以黃∶燈(10∶6)作用更明顯(表1)。

2.3 不同給藥組小鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C水平的比較

將各組血清樣品分別按照TG、TC、LDL-C、HDL-C試劑盒說明書方法檢測，并計(jì)算。結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組小鼠的TG、TC、LDL-C明顯升高，而HDL-C明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明采用寒濕饑餓加高脂飼料喂養(yǎng)制作的氣虛血瘀模型是成功的。與模型組比較，除對HDL-C無明顯升高作用外，各配比組均能明顯降低TG、TC、LDL-C水平，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或0.05)，聯(lián)用較單用療效優(yōu)，綜合評價(jià)以黃∶燈(10∶6))組作用更明顯(表2)。

表1 不同給藥組小鼠凝血時(shí)間比較

注:與模型對照組比較，#P<0.05,##P<0.01；與黃∶燈(10∶6)比較，*P<0.05,**P<0.01

表2 不同給藥組小鼠TG、TC、LDL-C、HDL-C的比較

注:與模型對照組比較，#P<0.05,##P<0.01

3 討論

黃芪具有益氣固表、利水消腫等功效，其主要含有黃芪皂苷、多糖、黃酮等多個(gè)活性成分，現(xiàn)代臨床常用黃芪注射液治療缺血性腦血管疾病，有較好療效，其主要物質(zhì)基礎(chǔ)為皂苷類成分。燈盞細(xì)辛具有祛風(fēng)散寒，活血通絡(luò)止痛的功效，其主要含有黃酮、咖啡酸酯、酚酸類化合物等，在心腦血管疾病中療效確切。臨床在益氣活血法指導(dǎo)下，將黃芪、燈盞細(xì)辛注射液聯(lián)合應(yīng)用于腦卒中患者，在改善神經(jīng)損傷引起的多種臨床癥狀方面取得了優(yōu)于單用組或西醫(yī)對照組的療效。

本研究考察了燈盞細(xì)辛注射液與黃芪注射液聯(lián)用對氣虛血瘀證小鼠凝血功能及血脂水平等的影響，結(jié)果表明兩藥不同配比對氣血血瘀小鼠的凝血時(shí)間及TG、TC、LDL-C等指標(biāo)均有不同程度的改善作用，且兩藥聯(lián)用較單用組作用明顯，其中相對最佳配比為黃∶燈(10∶6)，體現(xiàn)了益氣活血法改善氣虛血瘀證的協(xié)同作用，為后續(xù)課題的開展奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。課題組將在該模型基礎(chǔ)上建立腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型，進(jìn)一步評價(jià)黃芪與燈盞細(xì)辛聯(lián)用對氣虛血瘀證腦缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用，并確證其最優(yōu)配比及相關(guān)機(jī)制。

[1]Dajas F, Rivera-Megret F, Blasina F,etal. Neuroprotection by flavonoids[J]. Braz J Med Biol Res,2003, 36(12): 1613-1620.

[2]劉清， 劉曉楓，李強(qiáng).燈盞細(xì)辛注射液合黃芪注射液治療缺血性腦卒中107例臨床研究[J]. 中國初級(jí)衛(wèi)生保健,2004, 18(7): 81-82.

[3]羅翌, 葉燁,梅廣源,等.黃芪注射液合燈盞細(xì)辛注射液治療急性腦梗死40例療效觀察[J].新中醫(yī),2005,37(5):44-45.

[4]蘇露煜, 李恒,李登科.黃芪和燈盞細(xì)辛注射液聯(lián)合治療腦梗塞45例[J].吉林中醫(yī)藥,2007,27(4):23-24.

[5]王大偉， 張宏業(yè)，羅翌，等. 益氣活血法對缺血性腦卒中急性期(氣虛血癖證)神經(jīng)保護(hù)作用的影響[J].新中醫(yī),2006,38(9):31-32.

[6]王鍵， 趙輝，李凈，等.多因素復(fù)合制作氣虛血瘀證腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷膶?shí)驗(yàn)研究[J].中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2001,9(4):216-220.

[7]婁金麗， 張?jiān)蕩X，鄭宏，等.氣虛血瘀證動(dòng)物模型研究的思路與方法[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006,29(2):87-90.

[8]任建勛， 林成仁，劉建勛，等. 多因素復(fù)合刺激誘導(dǎo)建立大鼠氣虛血瘀證動(dòng)物模型的探索性研究[J]. 中國中藥雜志.2011,36(1):72-76.

[9]唐志書， 郭立瑋，王斌，等. 基線等比增減設(shè)計(jì)法優(yōu)選PNS/TGCO組分對實(shí)驗(yàn)性氣虛血瘀型冠心病的影響研究[J]. 中藥材,2010，33(9):1439-1442.

[10] 王霜， 趙興冉，南星梅，等. 基于基線等比增減設(shè)計(jì)法優(yōu)選葛根-黃連抗消渴最佳配比[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志. 2014,20(20): 128-131.

[11] 盛艷梅， 陳磊，謝興亮. 基于基線等比增減設(shè)計(jì)法優(yōu)選黃芪多糖-皂苷的免疫調(diào)節(jié)最佳配比[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2016.36(1)：59-62.

The Effect of Different Ratios of Astragalus Injection and Erigeron Breviscapus Injection on the Mice with Syndrome of Qi Deficiency and Blood Stasis on the Basis of Increase-decrease Baseline Geometric Proportion Design Method

LiJicao,WangFengguang,WangKui,ZhangYu,DengRui,ShengYanmei△.

SchoolofPharmacy,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China

Objective To observe the effect of different ratios of astragalus injection (AT) and Erigeron breviscapus injection (EB) on the mice with syndrome of Qi deficiency and blood stasis, and explore the optimum ratio. Methods The mouse models with syndrome of Qi deficiency and blood stasis were established and randomly divided into the control group, the model group, and the treatment groups with different AT-EB ratios including 10∶0, 10∶3, 10∶6, 10∶10, 1∶10, 0∶10 on the basis of the increase-decrease baseline geometric proportion design method. Then the clotting time and the TG, TC, LDL-C and HDL-C levels of serum were detected．Results Compared with the model group, The treatment groups with different AT-EB ratios can significantly prolong the clotting time (P<0.01 or 0.05) except that with the ratio of 10∶0. the level of HDL-C wasn′t changed significantly, but the levels of TG, TC and LDL-C decreased significantly in all the treatment groups with different ratios (P<0.01 or 0.05), and the treatment group with the ratio 10∶6 showed better effect than the other treatments. Conclusion The combined therapy of astragalus injection and erigeron breviscapus injection can improve the syndrome of Qi deficiency and blood stasis in mice to different degrees, and the combined administration has better effect than the single one. The optimum ratio is 10∶6.

Astragalus injection; Erigeron breviscapus injection; Combination; Syndrome of Qi deficiency and blood stasis

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20161125.1107.012.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.06.004

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No:81403311); 國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(No:201513705026)

R 285.5

A

△通信作者： 盛艷梅，E-mail：467131233@qq.com