蔡凌峰,王慧賢,林觀康,黃東暉△

1. 廣州中醫(yī)藥大學 (廣州 510000)；2廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院 呼吸內(nèi)科(珠海 519000)；3.廣州市中西醫(yī)結合醫(yī)院 呼吸內(nèi)科(廣州 510000)

·論 著·

痰熱清注射液對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠氣道黏液高分泌的影響*

蔡凌峰1,王慧賢2,林觀康3,黃東暉2△

1. 廣州中醫(yī)藥大學 (廣州 510000)；2廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院 呼吸內(nèi)科(珠海 519000)；3.廣州市中西醫(yī)結合醫(yī)院 呼吸內(nèi)科(廣州 510000)

目的 觀察痰熱清注射液對慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)模型大鼠氣道黏液高分泌的影響，探討“清熱化痰”的效應機制。方法 采用簡單隨機法將SD大鼠60只分為正常組、模型組和痰熱清組，每組20只。采用香煙煙熏加氣道內(nèi)滴注脂多糖的方法建立COPD大鼠模型，于實驗第41日開始，痰熱清組予痰熱清注射液、模型組及正常組予生理鹽水腹腔注射，1次/d，連續(xù)10 d。運用實時熒光定量聚合酶鏈式反應法(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測大鼠肺組織中黏蛋白5AC(MUC5AC)mRNA水平，并觀察肺組織病理形態(tài)的變化。結果 RT-PCR檢測顯示，痰熱清組MUC5AC mRNA的表達程度較模型組低(P<0.05)。病理學檢測(HE染色)示模型大鼠肺組織出現(xiàn)肺泡壁破裂、肺泡腔擴大、肺泡融合，并伴有炎細胞浸潤。過碘酸雪夫染色(AB-PAS)下可見痰熱清組大鼠支氣管黏膜上皮內(nèi)杯狀細胞較模型組明顯減少，痰熱清組PAS陽性區(qū)域面積明顯小于模型組(P<0.05)。結論 痰熱清注射液能抑制COPD模型大鼠MUC5AC mRNA的表達，并可能藉此減輕氣道黏液高分泌，改善氣道阻塞。

痰熱清注射液；慢性阻塞性肺疾??；氣道黏液高分泌；MUC5AC mRNA

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)居全球死亡原因第4位，世界衛(wèi)生組織研究顯示,COPD的全球經(jīng)濟負擔至2020年將攀至所有疾病的第5位[1]。氣道黏液高分泌是COPD的主要特征之一,也是COPD急性發(fā)作和預后變差的獨立危險因素；既易致呼吸道細菌定植，又會使肺通氣功能下降。然而，目前氣道黏液高分泌的治療療效不佳，患者從中獲益極小，故其已成為COPD防治研究的新熱點。現(xiàn)代中醫(yī)學研究認為，COPD急性加重時證候多為痰熱壅肺證[2-3]，而清熱化痰法則是逆轉COPD急性加重的重要治法；研究證明祛痰中藥可減少黏液分泌量，降低痰黏稠度，從而縮短氣道黏液高分泌亢進狀態(tài)的時間[4-5]，同時大量研究已證實痰熱清注射液具有抗炎、祛痰止咳的效果，對慢性支氣管炎和慢性阻塞性肺病急性加重具有顯著作用[6-7]。本研究采用氣道內(nèi)滴注脂多糖聯(lián)合煙熏的復合方法建立COPD大鼠模型，通過觀察肺組織杯狀細胞增生程度及RT-PCR法檢測MUC5AC蛋白轉錄子表達，探討痰熱清注射液的效應機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥物 痰熱清注射液(10 mL/支)，上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號Z20030054；脂多糖(LPS)，貨號L2880-10MG。大前門香煙，焦油量23 mg/支，上海卷煙廠。

1.1.2 實驗動物 清潔級健康SD大鼠，雄性，共60只，鼠齡10～12周，體質量(200±20) g，購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證號4400210000 4220。動物適應性飼養(yǎng)2 d后開始實驗，于實驗流程第1天采用隨機數(shù)字表法將其隨機分為3組：正常組、模型組和痰熱清組，每組20只，記錄大鼠體質量。

1.1.3 主要儀器與試劑 Veriti 96-Well Thermal Cycler PCR儀(Thermo Scientific公司)；7500 Real Time PCR System熒光定量基因擴增儀(Thermo Scientific公司)；Allegra X-22R多功能臺式冷凍離心機(Beckman Coulter 公司)； Eppendorf 系列微量移液器(德國 Eppendorf 公司)；光學顯微鏡、顯微攝像儀(日本OLYMPUS 公司)；自制動物熏吸箱(60 cm×50 cm×40 cm)。SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus，型號RR820A，批號AK6703)；PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time，型號RR036A，批號A3601-1)；上述試劑盒均由Takara公司生產(chǎn)；Trizol(型號15596026)由invitrogen公司生產(chǎn)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物造模及給藥方法 在第1、8和15天，用1%的戊巴比妥鈉(40 mg /kg) 腹腔注射麻醉，仰臥位固定于大鼠固定板，暴露聲門，將18號靜脈套管針快速插入氣管，拔出針芯，用1 mL 注射器注入溶于生理鹽水的LPS 200 μL(1 g/L) ，然后將大鼠固定板直立旋轉，使LPS 能夠均勻分布于兩肺。正常組同期氣管內(nèi)注入生理鹽水，其余無特殊處理。第2～40天(第8、15天除外)將大鼠置入熏吸箱內(nèi)，內(nèi)熏10支香煙，每天上午、下午各30 min。實驗第41～50天停止煙熏，痰熱清組予痰熱清注射液腹腔注射(痰熱清注射液以1∶5的比例用生理鹽水稀釋，劑量按成人最大40 mL/60 kg計算)，每日一次；正常組及模型組則予腹腔注射相應體積的生理鹽水，每日一次。以上給藥共10 d。

1.2.2 取材及標本制備方法 從實驗第51天起進行取材及指標檢測。1 %(40 mg/kg)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，腹主動脈放血處死動物，開胸取左肺迅速置入-80 ℃超低溫冰箱保存，用于RT-PCR檢測；每組隨機選取7只大鼠，取右肺用4 %多聚甲醛灌注固定，石蠟包埋，行HE染色及AB-PAS染色；每張切片隨機選取4個視野，各取照片1張(HE：100 ×，AB-PAS：400 ×)。

1.2.3 RT-PCR檢測方法 左肺制作組織勻漿后，從組織勻漿中以Trizol法提取RNA，再按試劑盒說明書步驟以RT-PCR法檢測組織中MUC5AC mRNA表達程度 (引物序列見表1)。

表1 引物序列

1.3 圖片處理

運用Image-pro Plus(v6.0)對攝取的AB-PAS染色切片圖像進行計算。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 一般資料

共60只實驗動物，實驗過程中死亡5只，其中痰熱清組3只，模型組2只，分別于實驗第8日、第15日氣道內(nèi)滴入LPS后或其后2 d內(nèi)的煙熏中死亡?？赡艿乃劳鲈驗樵炷：蟠笫蟮幕A狀況及肺功能明顯變差，對麻醉藥物以及煙熏的耐受程度下降。

2.2 HE染色觀察

對3組大鼠肺組織病理切片進行觀察，正常組可見肺內(nèi)各級支氣管黏膜上皮細胞排列整齊，支氣管周圍無明顯炎癥細胞浸潤；肺泡結構連續(xù)，肺泡壁完整。模型組則可見支氣管黏膜充血水腫，上皮細胞變性壞死糜爛脫落，支氣管周圍大量慢性炎性細胞浸潤；肺泡管、肺泡囊及肺泡明顯擴大，間隔變薄、斷裂，肺泡擴大融合形成大的囊腔。痰熱清組與模型組相比，支氣管黏膜上皮細胞變性壞死以及炎細胞浸潤程度均明顯減輕，肺大泡數(shù)量減少。提示痰熱清注射液能減輕炎癥反應程度，還可減輕危險因素對肺泡結構的破壞 (圖1)。

2.3 AB-PAS染色觀察

正常組大鼠肺組織病理切片未見支氣管黏膜含有紫紅色顆粒的杯狀細胞。在模型組大鼠肺組織病理切片中，則可見支氣管黏膜上皮含有較多杯狀細胞。痰熱清組大鼠肺組織與模型組相比，支氣管黏膜上皮內(nèi)杯狀細胞明顯減少(結果見圖2)。黏液PAS反應陽性，鏡下呈現(xiàn)紫紅色，模型組、痰熱清組PAS陽性區(qū)域面積均大于正常組，痰熱清組PAS陽性區(qū)域面積明顯小于模型組(表2)，提示痰熱清注射液能抑制杯狀細胞化生，減少黏液分泌。

圖1 HE染色各組肺組織病理切片(100 ×)

注：A.正常組；B.模型組；C.痰熱清組

圖2 AB-PAS染色各組肺組織病理切片(400 ×)

注:與正常組相比，其余兩組陽性面積較大，aP<0.001，bP=0.048；與模型組相比，痰熱清組面積較小，cP=0.027；以上差異均有統(tǒng)計學意義

2.4 MUC5AC mRNA表達程度

肺組織中MUC5AC mRNA表達比較，痰熱清組2-△△CT值低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(表3)。

表3 肺組織中MUC5AC mRNA比較

3 討論

氣道黏液高分泌是COPD的主要特征，也是其急性發(fā)作和預后變差的獨立危險因素，對此進行針對性治療具有重要意義。一方面，存在氣道黏液高分泌和反復發(fā)作的患者FEV1下降程度更嚴重[8]；氣道黏液高分泌使得病原體定植及氣道阻塞加重，進而使COPD急性發(fā)作頻率和病死率升高[9-10]。另一方面，針對氣道病理性黏液的治療可改善COPD的癥狀、減少發(fā)作頻率、減緩疾病進展[11]。因此，在慢性阻塞性肺病的評估與治療方面，應充分考慮氣道黏液高分泌的重要作用[12]。

氣道黏液高分泌的產(chǎn)生與炎癥反應、氧化應激、蛋白酶失衡和膽堿能神經(jīng)功能紊亂等多種病理生理機制有關。數(shù)種機制的中間關鍵環(huán)節(jié)均為對MUC基因表達的調控。IL-1β可通過與其受體IL-1R結合增強環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)活性，進而通過環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)通路上調MUC基因表達。TNF-α可活化NF-κB，隨之NF-κB移入細胞核，使得MUC基因表達上調。中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophi elastase,NE)可通過蛋白酶激活受體2(protease activated receptor-2,PAR2)增加細胞內(nèi)鈣濃度，由此激活蛋白激酶C (protein kinases-C,PKC)，進一步導致MUC5AC的分泌[13]。抑制NE的藥物可降低MUC的轉錄水平[14]，也說明了NE對MUC基因存在調控作用。上述多種機制導致MUC基因表達上調，進而導致杯狀細胞增生/化生，黏蛋白分泌增加。在慢性氣道炎癥性疾病中，病理性黏蛋白分泌增加，主要表型是MUC5AC，同時杯狀細胞產(chǎn)生的黏蛋白MUC5AC 被認為是該細胞增生的標志[15]；在COPD急性發(fā)作期MUC5AC mRNA表達水平顯著增高。COPD急性加重時，杯狀細胞分泌為主的、過度的MUC5AC表達具有突出病理意義[16]。

氣道黏液高分泌屬于中醫(yī)“痰熱壅肺證”范疇，現(xiàn)代藥理研究證實痰熱清注射液在治療慢性阻塞性肺疾病急性加重時可取得較好的療效[17-18]，但其發(fā)揮清熱化痰功效的機理尚未明確。因此，本研究通過觀察MUC5AC mRNA表達及肺組織杯狀細胞增生程度，探討痰熱清注射液清熱化痰的效應機制和對氣道黏液高分泌的影響。

本研究模型大鼠肺組織RT-PCR檢測結果顯示，痰熱清組的MUC5AC表達低于模型組，提示痰熱清注射液可以抑制MUC5AC mRNA的表達，說明痰熱清注射液可能通過調節(jié)MUC5AC mRNA的表達，抑制氣道黏液高分泌，改善氣道阻塞。

本研究中肺組織AB-PAS染色病理切片觀察結果顯示，與模型組相比，痰熱清組大鼠肺組織的杯狀細胞明顯減少；痰熱清組PAS陽性區(qū)域面積明顯小于模型組，說明在痰熱清注射液的干預下，杯狀細胞化生減少、增生程度降低，黏液分泌減少。因此，通過對MUC5AC mRNA表達的下調來減輕杯狀細胞增生/化生以及抑制氣道黏液高分泌，是痰熱清注射液“清熱化痰”效應產(chǎn)生的可能作用環(huán)節(jié)之一。

綜上所述，痰熱清注射液清熱化痰，使得肺氣宣發(fā)肅降無所阻礙，則咳止喘平。本研究展現(xiàn)了其作為COPD氣道黏液高分泌針對性治療藥物的潛力，為基于“清熱化痰”的氣道黏液高分泌治療研究提供了實驗依據(jù)。然而，痰熱清注射液干預氣道黏液高分泌的其他機制有待研究；其干預MUC5AC mRNA的上游機制尚未明確。清熱化痰藥物調控MUC5AC的多種分子通路的作用可能將成為下一步研究的熱點。

[1]Vestbo J, Hurd S, Agusti A,etal.Global strategy for the diagnosis,management,and prevention of chronic obstructive pulmonary disease, GOLD Revised 2011 [EB/OL]. (2011-12-30) [2012-03-15]. https://www.mendeley.com.

[2]王至婉， 李建生，余學慶，等. COPD急性加重期基礎證及特征的臨床調查研究[J].北京中醫(yī)藥大學學報,2010,33(10):703-708.

[3]陳凱佳， 梁直英. 500例慢性阻塞性肺疾病中醫(yī)證型規(guī)律探討[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志,2002,11(18):1755-1757.

[4]李文， 毛兵，王剛，等. 從氣道炎癥和氣道黏液高分泌研究清熱化痰法治療慢性阻塞性肺疾病急性加重期痰熱阻肺證的機制[J].中西醫(yī)結合學報,2008(8):799-805.

[5]鄔海橋， 丁陽平，周向東. 紅茶提取物在炎性氣道黏液高分泌中的作用[J]. 上海交通大學學報(醫(yī)學版),2009,29(2):126-129,144.

[6]潘穎， 付秀華，高俊珍，等. 痰熱清注射液聯(lián)合基礎療法治療AECOPD的療效及對血清細胞因子的影響[J]. 中醫(yī)藥導報,2015(15):66-69.

[7]龔國良， 李欣. 痰熱清注射液治療慢性阻塞性肺病急性加重期的臨床療效及細胞因子水平的研究[J]. 中國中藥雜志, 2009, 34(1): 104-105.

[8]Allinson J P,Hardy R,Donaldson G C,etal. The presence of chronic mucus hypersecretion across adult life in relation to COPD development[J]. Am J Respir Crit Care Med,2016,193(6):662-672.

[9]Silverman E K. Exacerbations in chronic obstructive pulmonary disease: do they contribute to disease progression[J]. Proc Am Thorac Soc, 2007,4(8):586-590.

[10] Langsetmo L,Platt R W, Ernst P,etal. Underreporting exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease in a longitudinal cohort[J]. Am J Respir Crit Care Med,2008,177(4):396-401.

[11] Fahy J V,Dickey B F. Airway mucus function and dysfunction[J]. N Engl J Med,2010,363(23): 2233-2247.

[12] Miravitlles M.Cough and sputum production as risk factors for poor outcomes in patients with COPD[J].Respir Med,2011,105(8):1118-1128.

[13] Zhou J, Perelman J M, Kolosov V P,etal. Neutrophil elastase induces MUC5AC secretion via protease-activated receptor 2[J].Mol Cell Biochem,2013,377(1):75-85.

[14] 王曉龍， 周向東. 中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑對慢性炎癥氣道高分泌的干預作用[J]. 臨床肺科雜志,2004,9(3):231-232.

[15] Rose M C,Voynow J A.Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease[J].Physiological Rev,2006,86(1):245-278.

[16] 周向東， 童瑾，蘭箭. 慢性阻塞性肺疾病患者氣道粘蛋白分子表型的研究[J]. 中華結核和呼吸雜志,2002,25(7): 437.

[17] 黃東暉， 李碩. 痰熱清注射液治療慢性阻塞性肺疾病急性加重期臨床觀察[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報, 2009, 11(10): 99-100.

[18] 王鐵瓊. 應用痰熱清治療慢性阻塞性肺病急性加重期患者的療效觀察[J].中國醫(yī)藥指南, 2010, 8(19): 280-281.

The Effect of Tanreqing Injection on the Airway Mucus Hypersecretion of COPD Rats

CaiLingfeng1,WangHuixian2,LinGuankang3,HuangDonghui2△.

1.GuangzhouUniversityofTCM,Guangzhou510000,China; 2.DepartmentofRespiratory,ZhuhaiBranchHospitalofGuangdongHospitalofTCM,Zhuhai519000,China; 3.DepartmentofRespiratory,GuangzhouHospitalofIntegratedTCMandWesternMedicine,Guangzhou510000,China

Objective To investigate the effect of Tanreqing injection on the airway mucus hypersecretion in rats with chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and explore the effect mechanism of “clearing heat and dissipating phlegm”. Methods 60 SD rats were randomly divided into the normal group, model group and experiment group, and each group consists of 20 rats. The models of COPD rats were established by means of cigarette smoking and tracheal instillation of lipopolysaccharide (LPS). The normal and model groups were given saline via intraperitoneal injection once per day from the 41st day to the 50th day of the experiment, while the experiment group was given Tanreqing injection once per day on the corresponding days. Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) was adopted to measure the gene expression levels of MUC5AC mRNA of the rats′ lung tissues, and the pathological section of these lung tissues were observed. Results The RT-PCR results showed that the expression levels of MUC5AC mRNA were significantly lower in the experiment group than in the model group (P<0.05). The results of HE staining showed that the rupture of alveolar wall, expansion of alveolar space, alveolar fusion, and infiltration of inflammation cells were observed in the model group. The results of alcian blue-periodic acid schiff stain (AB-PAS) showed that the goblet cells of the bronchial epithelium in the experiment group decreased significantly (P<0.05) and the positive staining areas of AB-PAS were also significantly smaller in the experiment group than in the model group. Conclusion Tanreqing injection can inhibit the expression levels of MUC5AC mRNA in the models of COPD rats, which can probably relieve their airway mucus hypersecretion and ameliorate their airway obstruction.

Tanreqing injection; Chronic obstructive pulmonary disease; Airway mucus hypersecretion; MUC5AC mRNA

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.06.003

廣東省科技計劃自籌經(jīng)費項目(No：00462830227154043)

R285.5

A

△通信作者：黃東暉，E-mail:13600001163@139.com