楊 智， 孫金剛， 牛 春， 張 萍

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司，寧夏銀川 750101)

泰妙菌素生產(chǎn)菌種原生質(zhì)體制備條件優(yōu)化

楊 智， 孫金剛， 牛 春， 張 萍

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司，寧夏銀川 750101)

[目的]探討泰妙菌素生產(chǎn)菌種原生質(zhì)體的最優(yōu)制備方法。[方法]通過(guò)對(duì)原生質(zhì)體制備條件進(jìn)行優(yōu)化，建立泰妙生產(chǎn)菌種原生質(zhì)體制備體系。[結(jié)果]優(yōu)化后制備條件：以培養(yǎng)3 d的菌絲體為材料，將其置于含質(zhì)量濃度0.10%溶壁酶、0.60 mol/L MgSO4的酶液中，25 ℃酶解3.0～3.5 h，將酶解液用G2砂芯漏斗過(guò)濾，濾液即為原生質(zhì)體懸液。采用該方法，泰妙生產(chǎn)菌種原生質(zhì)體制備率達(dá)1.5×106個(gè)/mL。[結(jié)論]試驗(yàn)結(jié)果為提高泰妙菌素生產(chǎn)菌種的產(chǎn)量提供了理論依據(jù)。

泰妙菌素;原生質(zhì)體;溶壁酶

延胡索酸泰妙菌素是新型獸用抗生素，對(duì)支原體及部分革蘭氏陽(yáng)性菌有良好的抗菌活性[1]，主要用于防治豬支原體肺炎、豬密螺旋體痢疾、雞慢性呼吸道疾病。該菌種遺傳背景資料較少，目前常采用誘變的手段進(jìn)行育種研究。原生質(zhì)體是誘變?cè)囼?yàn)的良好材料，對(duì)射線和化學(xué)誘變劑敏感，有利于提高突變率。筆者研究了泰妙菌素生產(chǎn)菌種原生質(zhì)體(以下簡(jiǎn)稱泰妙原生質(zhì)體)的制備方法，以期為提高泰妙生產(chǎn)菌種的產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌。泰妙菌素生產(chǎn)菌(Clitopilusprunulus)TMII14-28由寧夏泰瑞制藥股份有限公司菌種研究室保藏。

1.1.2 主要試劑。葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、瓊脂、溶壁酶(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司)、蝸牛酶(上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司)、纖維素酶。

1.1.3 主要儀器。LDZX-75KBS立式蒸汽壓力滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)、YT-CJ-2N雙人雙面凈化工作臺(tái)(北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司)、HZQ-F280全溫振蕩培養(yǎng)箱(江蘇省太倉(cāng)市華美生化儀器廠)、PSX智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(浙江省寧波萊福科技有限公司)。

1.1.4 培養(yǎng)基。斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯(浸提液)200 mg/g，葡萄糖20 mg/g，瓊脂20 mg/g，pH 6.50。種子瓶培養(yǎng)基：馬鈴薯(浸提液)200 mg/g，葡萄糖20 mg/g，pH 6.50。

1.2 方法

1.2.1 菌絲體的培養(yǎng)。取斜面培養(yǎng)基上3 cm2菌絲體置于組織研磨器中，充分研磨至無(wú)片狀菌絲，將菌懸液接種到種子瓶培養(yǎng)基中，25 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。

1.2.2 滲透液的配制。以磷酸鹽緩沖液(pH 6.86)為溶劑，配制終濃度為0.60 mol/L的MgSO4作為滲透液。

1.2.3 酶液的配制。以滲透液為溶劑配制終質(zhì)量濃度為0.10%的溶壁酶溶液，用0.45 μm濾膜過(guò)濾除菌，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.4 原生質(zhì)體的制備。取20 mL培養(yǎng)3 d的種子液，3 000 r/min離心10 min，收集菌絲。將20 mL過(guò)濾除菌的酶液加入到上述菌絲中，25 ℃酶解3.0～3.5 h，期間每隔0.5 h振蕩混勻1次，最后用G2砂芯漏斗過(guò)濾，收集濾液。用滲透液稀釋后，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.2.5 泰妙菌種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的確定試驗(yàn)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期的菌絲制備成原生質(zhì)體，其復(fù)蘇率最高，所以試驗(yàn)首先是確定泰妙菌絲體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。以泰妙斜面菌絲為材料，接種36瓶，每隔12 h測(cè)定1次菌絲濃度，繪制生長(zhǎng)曲線，確定菌種的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2.6 工作酶類型的確定試驗(yàn)。選擇纖維素酶、蝸牛酶、溶壁酶以及這3種酶的兩兩組合，作為工作酶。酶質(zhì)量濃度均為0.10%，pH為6.80，溫度為25 ℃，酶解時(shí)間為4.0 h，滲透液為0.60 mol/L MgSO4。期間每隔0.5 h振蕩混勻1次，最后顯微鏡觀察菌絲水解情況。顯微鏡放大倍數(shù)為10×100。

1.2.7 滲透液濃度的確定試驗(yàn)。用MgSO4配制不同濃度的滲透液，篩選適合泰妙原生質(zhì)體的滲透液濃度。

1.2.8 原生質(zhì)體分離方法的確定試驗(yàn)。選擇4種方法，篩選適合泰妙菌種的原生質(zhì)體分離方法，分別是：①將制備好的原生質(zhì)體懸液500 r/min離心10 min，收集沉淀；②將制備好的原生質(zhì)體懸液3 000 r/min離心10 min，收集沉淀；③將制備好的原生質(zhì)體懸液3 000 r/min離心10 min，收集沉淀，用等量滲透液完全溶解沉淀，重復(fù)離心，再收集沉淀，即用滲透液清洗1次沉淀，去除殘留的工作酶；④將制備好的原生質(zhì)體懸液用G2砂芯漏斗過(guò)濾，收集濾液。處理后顯微鏡觀察，顯微鏡放大倍數(shù)為10×100。

1.2.9 酶解時(shí)間的確定試驗(yàn)。以0.5～4.0 h為酶解時(shí)間，每隔0.5 h取樣1次，觀察結(jié)果，確定酶解時(shí)間。酶質(zhì)量濃度為0.04%，滲透液濃度為0.60 mol/L，溶壁酶濃度為0.10%，pH 6.80，溫度為25 ℃。

1.2.10 酶濃度的確定試驗(yàn)。為提高原生質(zhì)體得率，對(duì)溶壁酶質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)0.04%、0.10%、1.00%共3個(gè)梯度。其他條件：pH 6.80，溫度為25℃，滲透液為0.60 mol/L MgSO4，酶解時(shí)間為3.0～3.5 h。1.2.11 優(yōu)化條件驗(yàn)證試驗(yàn)。對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，泰妙原生質(zhì)體制備條件：工作酶為溶壁酶，質(zhì)量濃度為0.10%；滲透液為0.60 mol/L MgSO4；pH 6.80；溫度 25 ℃；酶解時(shí)間3.0～3.5 h；分離方法為G2砂芯漏斗過(guò)濾。通過(guò)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。2 結(jié)果與分析

2.1 泰妙菌種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的確定 由圖1可知，泰妙生產(chǎn)菌種的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為接種后46～103 h，選擇72 h，即處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期的菌絲為材料，制備原生質(zhì)體。

2.2 工作酶類型的確定 結(jié)果顯示，只有單獨(dú)使用溶壁酶能獲得泰妙原生質(zhì)體，獲得的原生質(zhì)體數(shù)量為1.2×105個(gè)，所以將溶壁酶作為工作酶。溶壁酶與其他2種酶組合時(shí)，未獲得原生質(zhì)體，是因?yàn)樵囼?yàn)使用的蝸牛酶和纖維素酶均為復(fù)合酶，其含有的蛋白酶將溶壁酶分解，使溶壁酶失去活性。單獨(dú)使用溶壁酶的酶解效果較好，這與陳鵬等[2]、張炳熾[3]、Hongg[4]、Cheng等[5]的研究結(jié)果一致。

2.3 滲透液濃度的確定 泰妙原生質(zhì)體失去了細(xì)胞壁的保護(hù)，由于胞內(nèi)為高滲狀態(tài)，很容易吸水從而導(dǎo)致細(xì)胞破裂。因此，制備原生質(zhì)體時(shí)需要環(huán)境提供合適的滲透壓力，以保證原生質(zhì)體的完整，防止細(xì)胞死亡。

圖1 泰妙菌種生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of Tiamulin production strains

結(jié)果表明：以0.55～0.80 mol/L MgSO4作為滲透液，均可以獲得再生單菌落，其中在0.60 mol/L 濃度下再生的單菌落數(shù)量最多，為21，所以選擇0.60 mol/L MgSO4作為滲透液。

2.4 原生質(zhì)體分離方法的確定 結(jié)果表明，G2砂芯漏斗過(guò)濾法是可行的泰妙原生質(zhì)體分離方法(圖2)。500 r/min離心10 min，離心力小，不能達(dá)到分離的目的，該方法甚至未獲得固形物，所以不適合泰妙原生質(zhì)體的分離。3 000 r/min離心10 min獲得固形物，但沒(méi)有觀察到原生質(zhì)體，可能是因?yàn)殡x心過(guò)程中原生質(zhì)體破碎。

注：a.500 r/min離心10 min；b.3 000 r/min離心10 min;c.3 000 r/min離心10 min，滲透液清洗1次；d.G2砂芯漏斗過(guò)濾。Note:a.500 r/min centrifuge for 10 min；b.3 000 r/min centrifuge for 10 min;c.3 000 r/min centrifuge for 10 min，and cleaning penetrant for one time;d.Filtering by G2 sand core funnel.圖2 原生質(zhì)體分離顯微鏡觀察結(jié)果Fig.2 Microscope observation result of protoplast separation

2.5 酶解時(shí)間的確定 由圖3可知，當(dāng)酶解時(shí)間在3.0～3.5 h，反應(yīng)趨于平衡，且有大量原生質(zhì)體釋放到滲透液中，再生的單菌落數(shù)量符合試驗(yàn)要求。因此，酶解時(shí)間確定為3.0～3.5 h。2.6 酶質(zhì)量濃度的確定 由圖4可知，3個(gè)質(zhì)量濃度條件下，均能觀察到原生質(zhì)體，其中在0.10%和1.00%質(zhì)量濃度條件下，原生質(zhì)體數(shù)量較多?？紤]到試驗(yàn)成本，確定溶壁酶質(zhì)量濃度為0.10%。

圖3 酶解時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Result of enzymatic hydrolysis time experiment

2.7 優(yōu)化條件驗(yàn)證 結(jié)果表明，采用該方法制備的原生質(zhì)體濃度為1.5×106個(gè)/mL。該研究建立的泰妙原生質(zhì)體制備體系高效、可靠，能夠清晰地觀察到原生質(zhì)體(圖5)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[6]。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)對(duì)泰妙原生質(zhì)體制備過(guò)程中各個(gè)步驟進(jìn)行優(yōu)化，最終確定：①菌絲體。采用種瓶培養(yǎng)3 d的菌絲，取20 mL菌絲體于無(wú)菌離心管中，3 000 r/min離心10 min，收集沉淀。②酶液。酶液為質(zhì)量濃度0.10%溶壁酶、0.60 mol/L MgSO4，用磷酸鹽緩沖液(pH 6.86)溶解，配制好后用0.45 μm濾芯過(guò)濾除菌。 ③酶解條件。向上述菌絲體加入20 mL酶液，25 ℃酶解3.0～3.5 h，期間每隔0.5 h振蕩混勻1次。④原生質(zhì)體分離方法。采用G2砂芯漏斗過(guò)濾分離。采用該方法制備的泰妙原生質(zhì)體濃度為1.5×106個(gè)/mL。

注：a.0.04%溶壁酶;b.0.10%溶壁酶;c.1.00%溶壁酶。 Note:a.0.04% dissolve enzyme;b.0.10% dissolve enzyme;c.1.00% dissolve enzyme.圖4 溶壁酶質(zhì)量濃度試驗(yàn)顯微鏡觀察結(jié)果Fig.4 Microscope observation result of dissolve enzyme concentration experiment

圖5 原生質(zhì)體顯微鏡觀察結(jié)果Fig.5 Microscope observation result of protoplast

該研究采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期的菌絲體為材料，開(kāi)展原生質(zhì)體制備試驗(yàn)。對(duì)數(shù)期的菌絲細(xì)胞壁薄且成分相對(duì)簡(jiǎn)單，有利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行[7]。采用傘菌科真菌制備原生質(zhì)體時(shí)，廣泛使用的溶壁酶為工作酶[3,7-8]。溶壁酶為復(fù)合型酶，具有β-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、蛋白酶活性[7-8]，能有效破除泰妙菌絲細(xì)胞壁。該研究通過(guò)濃度梯度試驗(yàn)，確定滲透液濃度為0.60 mol/L。合適的滲透液濃度有利于原生質(zhì)體的穩(wěn)定及得率的提高[7]。

[1] 黃賀賢,曾振靈,黃顯會(huì).截短側(cè)耳素類抗生素——泰妙菌素的研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸藥雜志,2010,44(6):42-45.

[2] 陳鵬,郭成金.金針菇原生質(zhì)體制備和再生探究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(9):200-204.

[3] 張炳熾.金針菇原生質(zhì)體制備和再生條件實(shí)驗(yàn)[J].山東師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1990,5(3):74-77.

[4] HONGG S W.Formation and regeneration of protoplasm inLentinusedodes[J].Mushroom newsletter for the tropics,1988，5(4):1-3.

[5] CHENG Y,BéLANGER R R.Protoplast preparation and regeneration from spores of the biocontrol fungusPseudozymaflocculosa[J].FEMS Microbiology Letters,2000,190(2):287-291.

[6] 董汪洋,王鄭隆，楊云喬，等.杏鮑菇的菌株篩選與原生質(zhì)體制備條件優(yōu)化[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，27(5):782-786.

[7] 王鑫,車振明，黃韜睿.原生質(zhì)體融合技術(shù)在微生物菌種選育中的應(yīng)用[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2008，29(10):174-176.

[8] 李艷麗.原生質(zhì)體技術(shù)篩選刺芹側(cè)耳高產(chǎn)多糖和漆酶菌株的研究[D].長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

Optimization on Protoplast Preparation Conditions of Tiamulin Producing Strain

YANG Zhi, SUN Jin-gang, NIU Chun et al

(Ningxia Tairui Pharmaceutical Company Co., Ltd.,Yinchuan,Ningxia 750101)

[Objective] The aim was to explore the optimal protoplast preparation method of Tiamulin producing strain.[Method] We established a system for protoplast preparation of Tiamulin producing strain by optimizing protoplast preparation conditions. [Result] The opotimal conditions were as followed:used 3 days cultured mycelium as material;put it into a solution which contain 0.10% lyticase, 0.60 mol/L MgSO4; hydrolyzed the mycelium with enzyme under 25 ℃ for 3.0-3.5 hours, then filtered the solution with G2 sintered discs;the filter liquor was protoplast suspension. By using this method, the protoplast preparation rate of Tiamulin producing strain could reach 1.5×106per milliliter.[Conclusion] The results provide theoretical basis for the improvement of Tiamulin producing strain.

Tiamulin;Protoplast;Lyticase

楊智(1987- )，男，寧夏石嘴山人，助理工程師，碩士，從事分子生物學(xué)研究。

2016-09-28

S 859.79+6

A

0517-6611(2016)35-0005-03