高 飛， 谷運(yùn)紅， 肖 靖， 張 明

(1．遵義醫(yī)學(xué)院物理教研室， 貴州遵義 563003；2．鄭州大學(xué)離子束生物工程省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南鄭州 450052)

離子束介導(dǎo)的小麥變異材料農(nóng)藝性狀及生理生化指標(biāo)分析

高 飛1， 谷運(yùn)紅2， 肖 靖2， 張 明1

(1．遵義醫(yī)學(xué)院物理教研室， 貴州遵義 563003；2．鄭州大學(xué)離子束生物工程省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南鄭州 450052)

[目的]探討離子束誘變和轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)作物誘變育種中的應(yīng)用效果。[方法]利用離子束介導(dǎo)外源基因組DNA轉(zhuǎn)化選育出一些特殊的小麥變異材料，研究在常溫水培、4 ℃冷脅迫、聚乙二醇(PEG)逆境條件下變異材料2葉期過(guò)氧化物酶(POD)活性、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性、脯氨酸(Pro)含量，以及成熟期株高、千粒重、葉綠素含量、蛋白質(zhì)含量等指標(biāo)的變化情況。[結(jié)果]經(jīng)過(guò)離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)化處理后的小麥變異系材料在各種逆境條件下生理生化指標(biāo)都有變化，并且一些材料相比對(duì)照表現(xiàn)出良好的優(yōu)越性；小麥變異系材料各農(nóng)藝性狀相比對(duì)照均有明顯差異。[結(jié)論]離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)能創(chuàng)造豐富的小麥變異類(lèi)型。

離子束；小麥變異材料；抗逆性；農(nóng)藝性狀

小麥?zhǔn)俏覈?guó)重要的糧食作物之一[1]。用各種高新技術(shù)改良種子或創(chuàng)建新的種質(zhì)資源，可優(yōu)化生物過(guò)程、發(fā)展農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)、提高轉(zhuǎn)化效率[2]。離子束育種技術(shù)已被應(yīng)用于小麥[3]、水稻[4]、大豆[5]、棉花[6]、煙草[7]等作物及微生物[8]。離子束育種技術(shù)在新生物品種改良以及誘變方面有顯著成效[9]。

目前，采用離子束技術(shù)進(jìn)行外源遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化主要包括2個(gè)方面，即離子束介導(dǎo)目的基因的遺傳轉(zhuǎn)化和離子束介導(dǎo)總DNA 的遺傳轉(zhuǎn)化[4]。當(dāng)植物受到不同環(huán)境因素脅迫時(shí)，植物中的脯氨酸(Pro)含量、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性、過(guò)氧化物酶(POD)活性會(huì)發(fā)生很大的變化，引起植物中脯氨酸含量、CAT活性、POD活性不同程度的積累，且積累指數(shù)與植物的抗逆性有關(guān)。筆者以利用離子束介導(dǎo)外源全基因組DNA轉(zhuǎn)化選育出的一些特殊的小麥變異材料作為研究對(duì)象，探討了離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)化對(duì)小麥變異材料農(nóng)藝性狀及生理生化指標(biāo)的影響，以期為離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)化在小麥育種中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗(yàn)材料是2004年通過(guò)離子束對(duì)小麥干種子以3×1017N+/cm2劑量注入，以200 μg/mL供體基因組DNA溶液浸泡所得，轉(zhuǎn)化供體為燕麥和六倍體小黑麥全基因組DNA，轉(zhuǎn)化受體為豫麥49(編號(hào)為8101)得到的變異材料。經(jīng)過(guò)多年的選育，得到一批特殊的變異系材料，材料編號(hào)及轉(zhuǎn)化組合的來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 變異材料信息

1.2 抗逆性脅迫模擬試驗(yàn) 對(duì)變異材料各挑選100粒完整、飽滿種子，70%乙醇消毒10 min，用蒸餾水沖洗3次，分成3份，每份30粒左右。用蒸餾水將種子浸泡在培養(yǎng)皿中24 h，用濾紙吸干種子表面水分，然后分為以下3組：常溫水培處理作為對(duì)照；4 ℃冷脅迫處理；聚乙二醇(PEG)溶液脅迫處理。取36個(gè)150 mm培養(yǎng)皿，鋪上雙層濾紙，高溫滅菌后儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1 水培方法。取出1組萌發(fā)的種子，將萌發(fā)種子的胚朝上，均勻擺放在培養(yǎng)皿中的濾紙上，放入20 ℃光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行水培，每天加入適量蒸餾水，以保持濾紙濕潤(rùn)。

1.2.2 脅迫培養(yǎng)方法。

1.2.2.1 4 ℃冷脅迫培養(yǎng)。取出1組萌發(fā)的種子，將萌發(fā)種子的胚朝上，均勻擺放在培養(yǎng)皿中的濾紙上，放入4 ℃光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行水培，每天加入適量蒸餾水，以保持濾紙濕潤(rùn)。

1.2.2.2 PEG脅迫培養(yǎng)。取出1組萌發(fā)的種子將萌發(fā)種子的胚朝上，均勻擺放在培養(yǎng)皿中的濾紙上，向培養(yǎng)皿中加入適量PEG溶液，放入20 ℃光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行水培，每天加入適量蒸餾水，以保持濾紙濕潤(rùn)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 脯氨酸含量的測(cè)定。待種子在培養(yǎng)箱生長(zhǎng)到2葉期時(shí)，稱取一定量葉片，用TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行脯氨酸含量測(cè)定。

將100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)脯氨酸配制成0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用分光光度計(jì)在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以O(shè)D520為橫坐標(biāo)，脯氨酸含量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=17.414x-0.775 4，式中y為脯氨酸含量(μg/g)，x為紫外吸光度。

1.3.2 POD、CAT活性的測(cè)定。待種子在培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)到2葉期時(shí)，稱取1 g幼苗，加入5 mL提取緩沖液，在冰浴條件下研磨成勻漿，4 ℃、4 000 r/min離心15 min，收集上清液，4 ℃保存，測(cè)量提取液總體積。POD、CAT活性測(cè)定方法及藥品配制均根據(jù)李玲的《植物生理學(xué)》中的實(shí)驗(yàn)方法[10]，略做修改。應(yīng)用TU-1901型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光值。每個(gè)樣品3次重復(fù)，用Origin 8.0軟件作圖。

1.3.3 小麥葉片SPAD值的測(cè)量。在2012年的4月10日、4月25日(抽穗期)、5月6日、5月12日、5月24日對(duì)材料頂1葉中部進(jìn)行測(cè)量，每個(gè)材料測(cè)3株，觀察不同時(shí)期葉綠素變化情況。

1.3.4 小麥種子蛋白質(zhì)含量、濕面筋、吸水率的測(cè)定。在接近成熟期時(shí)，每個(gè)材料隨機(jī)選取5株，測(cè)量株高，成熟收獲后測(cè)量每個(gè)材料的千粒重，用NIRsystems 5000型近紅外光譜儀測(cè)量變異材料籽粒的蛋白質(zhì)含量、濕面筋和吸水率。在對(duì)籽粒進(jìn)行近紅外光譜掃描前，將所有樣品置于光譜儀室平衡24 h，使樣品環(huán)境條件與儀器的環(huán)境條件一致。采集光譜時(shí)，將小麥樣品裝入樣品槽，使用機(jī)器內(nèi)置參比，掃描區(qū)間在1 100～2 498 nm，掃描步長(zhǎng)為2 nm，采集反射強(qiáng)度(R)，儀器將對(duì)每個(gè)樣品自動(dòng)進(jìn)行全區(qū)間掃描30次，取平均光譜。每個(gè)單株樣品設(shè)3次重復(fù)，掃描完光譜后將采集的光譜反射強(qiáng)度輸入計(jì)算機(jī)并轉(zhuǎn)化為log(1/R)存儲(chǔ)。按照遵義醫(yī)學(xué)院物理教研室建立的預(yù)測(cè)方程對(duì)樣品的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行預(yù)測(cè)。每個(gè)材料的20個(gè)單株都將獲得2個(gè)預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)含量值，其平均值為該品種材料的蛋白質(zhì)含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理 利用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)全生育期農(nóng)藝性狀考察結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同逆境條件下小麥變異材料脯氨酸含量分析 由圖1可知，在常溫水培條件下，材料8509、8512的脯氨酸含量均高于8101，材料8160、8505、8507、8508、8510、8511、8513、8340、5647的脯氨酸含量均低于8101；8512是所有材料中脯氨酸含量最高的，比8101脯氨酸含量高出15.00%，8505是所有材料中脯氨酸含量最低的，比8101脯氨酸含量低52.00%。

圖1 不同逆境條件下小麥變異材料脯氨酸含量Fig.1 Pro content of wheat variation materials under different adversity conditions

在PEG脅迫條件下，材料8160、8505、8507、8508、8513、8340、5627的脯氨酸含量均高于8101，材料8509、8510、8511、8512的脯氨酸含量均低于8101；8505是所有材料中脯氨酸含量最高的，比8101脯氨酸含量高出69.00%，8512是所有材料中脯氨酸含量最低的，比8101脯氨酸含量低33.00%。

在4 ℃冷脅迫條件下，材料8160、8505、8508、8509、8510、8511、8512、8513、8340、5647的脯氨酸含量均高于8101，8507脯氨酸含量低于8101；8509是所有材料中脯氨酸含量最高的，比8101脯氨酸含量高出206.00%，而8508是所有材料脯氨酸增長(zhǎng)比例最高的，比8101脯氨酸含量高出237.00%，8507是所有材料中脯氨酸含量最低的，比8101脯氨酸含量低13.00%。

因此，在不同逆境條件下，變異材料8160、8505、8508、8510、8513、8340、5647的脯氨酸含量在PEG和4 ℃冷脅迫條件下均高于自身對(duì)照，8509、8512在常溫水培條件下均高于8101，8160、8505、8508、8513、8340、5647在PEG和4 ℃冷脅迫條件下均高于8101，說(shuō)明在常溫水培條件下與8101對(duì)比，8509和8512脯氨酸含量較高，8160、8505、8508、8513、8340、5647在逆境條件下脯氨酸含量不僅比對(duì)照高而且比8101高，表明8160、8505、8508、8513、8340、5647可能具有較好的抗逆性。

2.2 不同逆境條件下小麥變異材料CAT活性分析 由圖2可知，在常溫水培條件下，材料8160、8508、8510、8511、8512的CAT活性均高于8101，材料8505、8507、8509、8513、8340、5647的CAT活性均低于8101；8160是所有材料中CAT活性最高的，比8101的CAT活性高出75.00%，5647是所有材料中CAT活性最低的，比8101的CAT值低46.00%。

在PEG脅迫條件下，材料8160、8505、8509、8512的CAT活性均高于8101，材料8507、8508、8510、8511、8513、8340、5647的CAT活性均低于8101；8505是所有材料中CAT活性最高的，比8101的CAT活性高出71.00%，8510是所有材料中CAT活性最低的，比8101的CAT活性低79.00%。

圖2 不同逆境條件下小麥變異材料CAT活性Fig.2 CAT activity of wheat variation materials under different adversity conditions

在4 ℃冷脅迫條件下，材料8509、8510、8512的CAT活性均高于8101，材料8160、8505、8507、8508、8511、8513、8340、5647的CAT活性均低于8101；8510是所有材料中CAT活性最高的，比8101的CAT活性高出103.00%，8160是所有材料中CAT活性最低的，比8101的CAT活性低12.00%。

因此，在不同逆境條件下，變異材料8505、8509的CAT活性在PEG和4 ℃冷脅迫下均高于自身對(duì)照，在常溫水培條件下8160、8508、8510、8511、8512的CAT活性均高于8101，8509、8512在PEG和4 ℃冷脅迫條件下均高于8101，說(shuō)明在常溫水培條件下與8101對(duì)比，8160、8508、8510、8511、8512的CAT活性較高，8509在逆境條件下的CAT活性不僅比對(duì)照高而且比8101高，表明8509可能具有較好的抗逆性。

2.3 不同逆境條件下小麥變異材料POD活性分析 由圖3可知，在常溫水培條件下，材料8510的POD活性高于8101，材料8512的POD活性接近8101，其他材料的POD活性均低于8101；8510是所有材料中POD活性最高的，比8101的POD活性高出1.74%，8508是所有材料中POD活性最低的，比8101的POD活性低92.17%。

圖3 不同逆境條件下小麥變異材料POD活性Fig.3 POD activity of wheat variation materials under different adversity conditions

在PEG脅迫條件下，材料8160、8508、8509、8510、8511、5947的POD活性均高于8101，材料8505、8507、8512、8513、8340的POD活性均低于8101；8160是所有材料中POD活性最高的，比8101的POD活性高出359.00%，8512是所有材料中POD活性最低的，比8101的POD活性低24.11%。

在4 ℃冷脅迫條件下，材料8160、8505、8509、8510、8511、8512、8513、8340、5647的POD活性均高于8101，材料8507、8508的POD活性均低于8101；5647是所有材料中POD活性最高的，比8101的POD活性高出613.00%，8508是所有材料中POD活性最低的，比8101的POD活性低37.50%。

因此，材料8160、8505、8509、8511、8340、5647的POD活性在PEG脅迫條件下均高于自身對(duì)照。在低溫條件下各材料POD活性都下降，在常溫水培條件下8510、8512的POD活性均高于8101，8610、8505、8509、8510、8511、5647在PEG和4 ℃冷脅迫條件下均高于8101，說(shuō)明在常溫水培條件下與8101對(duì)比，8510、8512的POD活性較高，8610、8505、8509、8511、5647在逆境條件下的POD活性不僅比對(duì)照高而且比8101有所提高，表明8610、8505、8509、8511、5647可能具有較好的抗逆性。

2.4 小麥變異系農(nóng)藝性狀分析 由表2可知，材料8340的株高與對(duì)照8101相比顯著降低，而8505、8507、8508、8509、8511、8512的株高極顯著增加；材料8160、8505、8340的千粒重與對(duì)照相比顯著增加，8511的千粒重極顯著增加；材料8508的蛋白質(zhì)含量與對(duì)照相比極顯著降低，而8160、8512、8513的蛋白質(zhì)含量顯著增加，8340的蛋白質(zhì)含量極顯著增加；材料8160、8512的濕面筋與對(duì)照相比顯著增加，8340的濕面筋極顯著增加；材料8160、8505、8507、8508、8509、8512、8513的吸水率與對(duì)照相比極顯著增加。

2.5 小麥變異系葉綠素農(nóng)藝性狀分析 SPAD是土壤與作物分析儀器開(kāi)發(fā) (Soil and Plant Analyzer Development)的英文縮寫(xiě)，日本基于葉綠素對(duì)不同類(lèi)型光吸收利用差異研制的葉綠素計(jì)(SPAD儀)可在田間條件下簡(jiǎn)單、無(wú)損地預(yù)測(cè)各類(lèi)作物葉片單位面積的葉綠素含量。植株葉片SPAD值與葉綠素含量呈顯著正相關(guān)。

由表3可知，4月25日，材料8505、8510、8512的SPAD值與對(duì)照8101相比顯著降低，而8511、8340的SPAD值極顯著降低；5月12日，材料8512、8340的SPAD值與對(duì)照相比極顯著降低，而8160的SPAD值極顯著增加；5月24日，材料8505、8506、8511的SPAD值與對(duì)照相比顯著降低，而8508、8509、8512、8340的SPAD值極顯著降低。

3 結(jié)論與討論

經(jīng)過(guò)離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)化處理后的小麥變異系材料不論是農(nóng)藝性狀還是抗逆性都有顯著變化，所以要從不同的角度分析出每個(gè)變異材料的特性，加深對(duì)變異材料變異類(lèi)型的了解，以指導(dǎo)育種實(shí)踐。

首先要分析的是離子束處理后得到的小麥變異系在逆境條件下的生理生化指標(biāo)，在常溫水培條件下與8101對(duì)比，材料8509和8512的脯氨酸含量較高，材料 8160、8508、8510、8511、8512的CAT活性較高，材料 8510、8512的POD活性較高，可知變異材料8512在水培條件下脯氨酸含量、CAT、POD活性相比對(duì)照均有所增加；在PEG模擬干旱和4 ℃冷脅迫條件下與8101對(duì)比，材料 8160、8505、8508、8513、8340、5647的脯氨酸含量較高并且比對(duì)照也高，材料8509、8512 的CAT活性較高，材料 8610、8505、8509、8511、5647的POD活性較高并且僅比對(duì)照高，可知變異材料8106、8505、5647 在逆境條件下脯氨酸含量、POD活性相比對(duì)照均有所增加，而材料8509、8512 在逆境條件下CAT活性相比對(duì)照均有所增加。綜上，經(jīng)過(guò)離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)化處理后的小麥變異系材料無(wú)論在常溫還是逆境條件下生理生化指標(biāo)都有所變化，并且一些材料相比對(duì)照表現(xiàn)出良好的優(yōu)越性。

表2 小麥變異系農(nóng)藝性狀

注：*和**分別表示P<0.05和P<0.01。

Note:*indicatedP<0.05;**indicatedP<0.01。

表3 小麥變異系在不同時(shí)期葉綠素含量(SPAD)

注：*和**分別表示P<0.05和P<0.01。

Note:*indicatedP<0.05;**indicatedP<0.01。

其次要分析的是離子束處理后得到的小麥變異系農(nóng)藝性狀，對(duì)材料的株高、千粒重、蛋白質(zhì)含量、濕面筋、吸水率進(jìn)行差異顯著性分析，得出小麥變異系材料各農(nóng)藝性狀相比對(duì)照均有明顯差異。

由此可見(jiàn)，離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)能創(chuàng)造豐富的小麥變異類(lèi)型，該研究為以后變異材料的改進(jìn)和利用提供了理論依據(jù)。參考文獻(xiàn)

[1] HISCHENHUBER C，CREVEL R，JARRY B，et al.Review article:Safe amounts of gluten for patients with wheat allergy or coeliac disease[J].Alimentary pharmacology & therapeutics,2006,23(5):559-575.

[2] 蘇張磊，戚艷磊，谷運(yùn)紅，等.離子束介導(dǎo)外源DNA導(dǎo)入小麥后代變異系有關(guān)分析[J].核技術(shù),2009,32(10):779-784.

[3] 蘇明杰，趙傳奇，秦廣雍.離子束介導(dǎo)外源基因群轉(zhuǎn)移小麥的研究[J].中州大學(xué)學(xué)報(bào),2003,20(2):119-121.

[4] 黃群策，李玉峰.離子束生物技術(shù)在水稻育種中的應(yīng)用前景[J].雜交水稻,2002,17(5):5-8.

[5] 吳麗芳，余增亮.離子注入法獲得大豆-小麥分子遠(yuǎn)緣雜種及后代的變異分析[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2000,14(4):206-211.

[6] 程備久，李展，田秋元，等.離子注入棉花種子M1代細(xì)胞學(xué)效應(yīng)研究初報(bào)[J].安徽農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),1991,18(4):329-331.

[7] 阮龍，林國(guó)平，唐圣華，等.氮離子注入煙草對(duì)當(dāng)代煙葉含鉀量的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2000，28(2):238-239.

[8] 宋道軍，姚建銘，吳麗芳，等.離子注入對(duì)微生物細(xì)胞的刻蝕與對(duì)DNA的損傷及修復(fù)[J].遺傳,1999,21(4):37-40.

[9] BIAN P,YU Z L.The technique of cenetic transformation mediated by keV ion beam[J].Plasma science & technology,2005,7(1):2693-2696.

[10] 李玲.植物生理學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社,2011:95-102.

Agronomic Traits and Physiological and Biochemical Index of Ion Beam Mediated Wheat Genome Variation

GAO Fei1, GU Yun-hong2, XIAO Jing2et al

(1.Physics Teaching Research Group, Zunyi Medical University, Zunyi, Guizhou 563003; 2.Henan Provincial Key Laboratory of Ion Beam Bioengineering, Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450052)

[Objective] The aim was to explore the great application value of ion beam mutagenesis and transgenic technology in crop mutation breeding. [Method] We carried out ion beam mediated whole genome DNA into some special variation of wheat materials,and then in conditions of normal temperature water, 4 ℃ cold stress and PEG stress, studied change of peroxidase (POD) activity,catalase (CAT) activity and proline (Pro) content of two-leaf variation materials, as well as the change of plant height, grain, chlorophyll content and protein content of variation materials at mature period.[Result] After dealing with the ion beam mediated transformation of wheat materials in all sorts of adversity under the condition of physiological and biochemical indexes were changed, and some material compared with contrast highlighted advantages.The agronomic traits of wheat materials compared with controls all had obvious difference.[Conclusion] The ion beam mediated transgenic technology can create rich wheat variation types.

Ion beam;The variation of wheat materials;Stress resistance;Agronomic trait

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(11375154)；鄭州大學(xué)校級(jí)教改項(xiàng)目(2014XJGLX101)。

高飛(1984- )，男，山西霍州人，講師，碩士，從事生物物理學(xué)研究。

2016-10-19

S 512.1

A

0517-6611(2016)35-0001-04