吳利玲

四川省南充市中心醫(yī)院藥劑科，四川 南充 637000

實(shí)驗(yàn)研究

白芨ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

吳利玲

四川省南充市中心醫(yī)院藥劑科，四川 南充 637000

目的：對(duì)白芨ISSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行建立以及優(yōu)化。方法：采用正交試驗(yàn)對(duì)影響白芨的ISSR-PCR反應(yīng)體系中的6個(gè)影響因素Taq DNA聚合酶、BSA、引物、模板DNA、dNTP、Mg2+進(jìn)行系統(tǒng)的篩選和優(yōu)化，尋找白芨ISSR-PCR的最優(yōu)條件。結(jié)果：經(jīng)過系統(tǒng)的優(yōu)化后，最終確立了最優(yōu)的白芨ISSR-PCR方案，50 μL反應(yīng)液中Taq DNA聚合酶為2.5U、BSA為7.5g/L、引物為5.0μmoL/L、模板DNA為200ng、dNTP為0.4mmoL/L、Mg2+為4.0mmoL/L。結(jié)論：試驗(yàn)結(jié)果得出最佳的白芨ISSR-PCR反應(yīng)體系，為后期合理有效的應(yīng)用ISSR方法對(duì)白芨遺傳資源的監(jiān)測(cè)提供了參考。

白芨；ISSR-PCR反應(yīng)體系；單因素試驗(yàn)；正交試驗(yàn)

白芨屬蘭科，其性味甘、苦、澀，微寒，主要?dú)w經(jīng)于肺[1]。白芨現(xiàn)已成為瀕臨滅絕的珍貴物種，對(duì)白芨遺傳資源的分類保護(hù)已成為人類研究的重大課題之一[2]。ISSR是近年來新興的一種分子標(biāo)記技術(shù)，在植物遺傳資源的保育工作中已得到普及使用[3]。PCR擴(kuò)增為ISSR的關(guān)鍵技術(shù)，主要受到6個(gè)因素的影響(Taq DNA聚合酶、BSA、引物、模板DNA、dNTP、Mg2+)[4]。研究采用單因素試驗(yàn)以及正交試驗(yàn)對(duì)影響白芨的ISSR-PCR反應(yīng)體系中的6個(gè)影響因素進(jìn)行優(yōu)化，尋找白芨ISSR-PCR反應(yīng)體系的最優(yōu)條件。

1 材料與方法

1.1 材料 白芨購自同仁堂，購得的白芨放置在干燥陰涼處儲(chǔ)存。

1.2 主要試劑與儀器 Taq DNA聚合酶、dNTP、100 bp DNA Ladder、BSA、Mg2+均購自克勞寧(北京)生物科技有限公司。PCR擴(kuò)增儀(PTC．200，美國MJ公司)、核酸檢測(cè)儀(Bio Photometer，美國Eppendoff公司)。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取 白芨基因組DNA的提取方法為改進(jìn)的CTAB法，并用核酸檢測(cè)儀測(cè)定獲得的DNA濃度，并用蒸餾水稀釋濃度為0.05g/L，放置在-20℃冰箱中儲(chǔ)存。

1.3.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件及其產(chǎn)物檢測(cè) 參考預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，退火溫度選擇52℃，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：4min預(yù)變性于94℃條件下，30s變性于94℃條件下，1min退火于52℃條件下，90s延伸于72℃條件下，共重復(fù)35次操作。取6μL所獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，行1h的電脈操作。用100 bp DNA Ladder作為參照物，1×TAE為緩沖液，5 V/cm恒壓條件，瓊脂糖凝膠為2.0%。

1.3.3 優(yōu)化方法 正交設(shè)計(jì)選取L25(56)的方案，反應(yīng)液為50μL，結(jié)果見表1。由正交實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果，選取數(shù)目多且清晰條帶的組合。

表1 白芨ISSR-PCR正交試驗(yàn)水平及因素

1.3.4 正交實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照優(yōu)化后的方法行三次ISSR-PCR反應(yīng)，分析所測(cè)定的條帶情況。

2 結(jié)果

2.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 6因素5水平的正交設(shè)計(jì)共產(chǎn)生25個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果見表2。Taq DNA：由電脈圖分析可得，當(dāng)Taq DNA為2.5U時(shí)條帶數(shù)目最多，且最清晰。BSA：由組別4的條件得到的電脈圖分析可知，選擇7.5g/L為BSA的最優(yōu)濃度。引物：從正交試驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)引物濃度為5.0 μmoL/L時(shí)電脈圖條帶數(shù)目最多、最清晰。DNA模板：按不同的濃度進(jìn)行加樣，其它因素均設(shè)為正交試驗(yàn)的最優(yōu)條件，由電脈圖可知，200ng為最適濃度。dNTP及Mg2+：分別按不同的濃度進(jìn)行加樣，其它因素均設(shè)為正交試驗(yàn)的最優(yōu)條件，分析圖譜，得出最優(yōu)值。

表2 正交實(shí)驗(yàn)直觀分析

2.2 正交實(shí)驗(yàn)直觀分析及方差分析 由表2、3可知，最優(yōu)的白芨ISSR-PCR方案，50μL反應(yīng)液中Taq DNA聚合酶為2.5 U、BSA為7.5g/L、引物為5.0μmoL/L、模板DNA為200ng、dNTP為0.4mmoL/L、Mg2+為4.0mmoL/L。結(jié)果分別見表2、表3。

表3 方差分析表

2.3 正交實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 正交實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)化后的方案穩(wěn)定、可行。具體結(jié)果見表4。

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

3 討論

白芨具有消腫止痛以及收斂止血的功效，臨床主要用于肺結(jié)核，百日咳，矽肺，十二指腸潰瘍急性穿孔，十二指腸潰瘍出血等疾病的治療[5]。如今，白芨已成為瀕危物種，對(duì)其進(jìn)行有效的育種至關(guān)重要，加之不同的白芨很難采用形態(tài)特征進(jìn)行區(qū)分，而分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)遺傳資源的保育十分重要[6]。隨著科技的進(jìn)步，人類對(duì)生物體的認(rèn)識(shí)已經(jīng)上升到微觀水平。通過測(cè)定微觀分子的水平的線性結(jié)構(gòu)(如DNA序列)，來橫向比較不同物種的差異[7]。ISSR簡(jiǎn)單易行，普遍應(yīng)用于物種區(qū)分、遺傳資源保育等領(lǐng)域。具有檢測(cè)成功率高、成本較低等特點(diǎn)。ISSR技術(shù)可在預(yù)先不知序列信息的前提下，能夠僅用一條引物以及基因組中眾多的簡(jiǎn)單重復(fù)序列就可以進(jìn)行PCR擴(kuò)增[8]。

PCR擴(kuò)增為ISSR的重要技術(shù)，主要的影響因素為Taq DNA聚合酶、BSA、引物、模板DNA、dNTP、Mg2+。故每個(gè)白芨物種都要制定不一樣的ISSR-PCR條件。由于單因素試驗(yàn)對(duì)所考察的因素水平進(jìn)行逐一分析，任務(wù)量過大，操作過于繁瑣，且無法考察各因素相互的影響作用，故本研究不予單獨(dú)采用。正交試驗(yàn)可全面考察各因素之間的相互影響作用，且能分析各因素之間的輕重次序。正交試驗(yàn)的缺點(diǎn)為測(cè)定結(jié)果精密度較差，且對(duì)技術(shù)水平要求過高。正交試驗(yàn)與單因素試驗(yàn)具有互補(bǔ)的作用，故本研究將兩者結(jié)合的試驗(yàn)方法進(jìn)行優(yōu)化。最終對(duì)影響ISSR-PCR反應(yīng)體系的Taq DNA聚合酶、BSA、引物、模板DNA、dNTP、Mg2+因素進(jìn)行系統(tǒng)篩選，得到了最優(yōu)的反應(yīng)條件(50 μL反應(yīng)液中Taq DNA聚合酶為2.5 U、BSA為7.5g/L、引物為5.0μmoL/L、模板DNA為200ng、dNTP為0.4mmoL/L、Mg2+為4.0mmoL/L)。本實(shí)驗(yàn)在不設(shè)重復(fù)時(shí)，試驗(yàn)隨機(jī)誤差分散式隱含在正交表各列之中，由于隨機(jī)誤差與模型誤差相對(duì)混雜，而且較大，至使F檢驗(yàn)的誤差均方差相對(duì)較大。

綜上所述，試驗(yàn)結(jié)果得出最佳的白芨ISSR-PCR條件，為ISSR技術(shù)在白芨物種鑒別方面提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(編輯：陶希睿)

2016-10-12

吳利玲(1989-)，女，碩士，初級(jí)藥師，研究方向?yàn)樗幏靠剖夜芾怼-mail:fuyun-hb@126.com

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