郭 霞，孫建華，孫振中，劉菁華，黃雪玲，劉云璐,陳 琳

(上海市水產(chǎn)研究所，上海 200433)

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水產(chǎn)品中喹烯酮和喹賽多及其主要代謝物殘留的HPLC-MS/MS檢測方法研究

郭 霞*，孫建華，孫振中，劉菁華，黃雪玲，劉云璐,陳 琳

(上海市水產(chǎn)研究所，上海 200433)

水產(chǎn)品；喹烯酮；喹賽多；代謝物；高效液相色譜-串聯(lián)質譜(HPLC-MS/MS)

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TSQ QUANTUM ACCESS高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀(美國Thermo公司)；電子天平(XS105，梅特勒-托利多儀器有限公司)；高速冷凍離心機(Centrifuge 5810R，艾本德國際貿(mào)易有限公司)；旋轉蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；Oasis MAX固相萃取柱(60 mg，3 mL，美國Waters公司)；Milli-Q超純水儀(法國Millipore公司)。

1.2 溶液的配制

標準溶液：準確稱取適量的QCT,CYA,BDQCT,MQCA,BDCYA,QCA標準品，先用2 mL二甲亞砜溶解，再用甲醇稀釋并定容，CYA先用2 mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，再用甲醇稀釋并定容，分別配制成質量濃度為100 μg/mL的標準物質儲備溶液，-20 ℃保存，有效期1個月;混合標準工作溶液：準確移取適量6種分析物標準儲備溶液，用甲醇稀釋至質量濃度為10 μg/mL，-20 ℃保存，有效期1個月。

0.3 mol/L鹽酸溶液：移取2.7 mL濃鹽酸，加水稀釋定容至100 mL;

0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.6)：稱取2.7 g磷酸二氫鉀加700 mL水溶解，用0.05 mol/L氫氧化鉀調至pH 7.6，加水稀釋至1 L。

表1 梯度洗脫條件

1.3 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge C18色譜柱(100 mm×2.1 mm i.d.,粒徑3.5 μm)；流速：0.25 mL/min；進樣量：25 μL；流動相由乙腈、甲醇和0.1%甲酸溶液組成，梯度洗脫程序見表1。

1.4 質譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；離子化方式：正離子；掃描方式：選擇反應監(jiān)測(SRM)；電噴霧電壓：4 000 V；離子傳輸管溫度：350 ℃；鞘氣流量：30 mL/min；輔助氣流量：8 mL/min；碰撞氣：氬氣；其它優(yōu)化的質譜條件見表2。

表2 喹烯酮和喹賽多及其主要代謝物的優(yōu)化質譜條件

*quantitation ion

1.5 樣品前處理

稱取均質后的組織樣品5.00 g(精確至0.02 g)于50 mL聚丙烯離心管中，加入15 mL乙腈-乙酸乙酯(1∶1)進行提取，渦旋混勻，振蕩提取2 min，然后于4 ℃，6 000 r/min離心10 min，將上清液轉移至100 mL雞心瓶。向殘渣中加入15 mL乙腈-乙酸乙酯(1∶1)提取液，重復提取1次，上清液轉至同一雞心瓶。殘渣中加入10 mL 0.3 mol/L鹽酸溶液，渦旋混勻2 min，超聲提取10 min,然后于4 ℃，6 000 r/min離心10 min，上清液轉移至另一離心管中，向離心管中加入15 mL乙酸乙酯振蕩提取5 min，6 000 r/min離心10 min，上清液合并至雞心瓶中，繼續(xù)向離心管中加入15 mL乙酸乙酯重復提取1次，上清液轉至雞心瓶。向雞心瓶中加入3 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.6)后，于40 ℃旋轉蒸發(fā)至約3 mL。

將MAX固相萃取柱依次用3 mL甲醇、3 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液活化、平衡，將雞心瓶中的溶液上樣，自然重力下流出，向雞心瓶中加入1 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液清洗雞心瓶，將清洗液過柱。3 mL水洗滌雜質后用4 mL 2%甲酸甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，40 ℃下氮吹至干，加入1 mL 0.1%甲酸-乙腈(9∶1)溶液，渦動混勻，裝入棕色進樣小瓶，供HPLC-MS/MS測定。

1.6 標準曲線的繪制

用混合標準工作溶液和各組織樣品經(jīng)前處理后獲得的基質空白溶液配制成2，5，10，50，100，500 μg/L的系列標準溶液，取25 μL進樣分析。分別以各分析物的峰面積(Y)為縱坐標，質量濃度(X，μg/L)為橫坐標繪制標準曲線，求回歸方程及相關系數(shù)。各組織樣品中分析物的濃度采用組織樣品的基質添加標準曲線法測定。

2 結果與討論

2.1 標準儲備溶液的配制

在配制標準儲備液過程中，向標準物質中先加入2 mL二甲亞砜進行溶解，再加入甲醇稀釋并定容，發(fā)現(xiàn)QCT,BDQCT,MQCA,BDCYA和QCA的溶解度較好，得到均一透明的儲備液。但CYA的溶解度較差，配制的儲備液渾濁，影響了儲備液的準確度和儀器檢測靈敏度。后改用2 mL N,N-二甲基甲酰胺溶解CYA，再用甲醇稀釋定容的方法可獲得均一穩(wěn)定的CYA標準儲備液。

2.2 提取條件的選擇

2.3 固相萃取柱的選擇

殘留檢測的常用凈化方法有液液萃取法和固相萃取柱法。液液萃取法的試劑用量相對較大，而固相萃取柱法采用的試劑量少，凈化效果好，故本研究選用固相萃取柱法凈化樣品。文獻常用的固相萃取柱有C18柱[18-19,21]、MAX柱[15,17,22-23]及HLB柱[9,11,20,24]等。本實驗根據(jù)被分析物的性質選用MAX固相萃取柱凈化樣品，分別對上樣液和洗脫液的種類及用量進行篩選和優(yōu)化。MAX固相萃取柱是混合陰離子交換柱，是反相和強陰離子交換的復合模式，由于QCT，BDQCT，CYA和BDCYA的脂溶性較大，均利用反相機制在小柱上保留、洗脫，而MQCA和QCA利用離子交換機制被保留和洗脫。上樣液選用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.6)，此時MQCA和QCA在堿性磷酸鹽緩沖溶液中呈離子態(tài)，利用離子交換機制被保留在萃取柱上。MQCA和QCA在酸性溶液中呈分子態(tài)，能夠從離子交換柱上被洗脫下來，實驗選用不同體積的含2%甲酸的甲醇溶液和含2%甲酸的乙腈溶液作洗脫液進行比較，結果顯示以4 mL 2%的甲酸甲醇作洗脫液得到的回收率最高，回收率均大于90%。

2.4 色譜條件的選擇

2.5 質譜分析

采用流動注射方式單標進樣，流速10 μL/min，在質荷比(m/z)為100～500范圍內對6種待測物(5 μg/mL)進行一級質譜圖掃描，確定QCT，BDQCT，MQCA，CYA，BDCYA及QCA的分子離子分別為m/z307.0，275.0，189.0，271.8，240.0和174.9。然后對其進行二級質譜分析，分別選取豐度最強的離子作為定量離子，以次強離子作為定性離子(見表2)。優(yōu)化碰撞電壓等其他質譜分析條件。圖1為草魚空白樣品添加QCT，BDQCT，MQCA，CYA，BDCYA及QCA的特征離子色譜圖，添加濃度為5 μg/kg。由圖可見，樣品中被分析物的保留時間處無雜峰干擾。

2.6 線性關系、檢出限與定量下限

按照“1.6”繪制標準曲線，草魚、南美白對蝦、中華絨鰲蟹不同組織樣品中6種分析物的基質添加標準曲線方程及相關系數(shù)見表3。從表3可見，6種目標分析物的濃度在2～500 μg/L范圍內與其峰面積呈線性相關，相關系數(shù)均大于0.98。實驗采用空白組織樣品中添加目標組分的方法，按前處理步驟和儀器條件進行處理和檢測，以特征離子色譜峰信噪比(S/N)大于3為檢出限(LOD)，大于10為定量下限(LOQ)，確定不同組織中各化合物的檢出限和定量下限(見表3)，得不同組織中各化合物的LOD為0.5～1.6 μg/kg，LOQ為2.0～5.0 μg/kg，檢出限較低。

表3 不同組織中6種待測物的基質添加標準曲線、相關系數(shù)(r2)、檢出限及定量下限

2.7 回收率與精密度

分別準確稱取(5.00±0.02) g的草魚、南美白對蝦、中華絨鰲蟹空白樣品組織，每種組織樣品以5，10，50 μg/kg進行3個濃度的加標回收實驗，將不同體積的混合標準工作液添加到空白樣品中，靜置15 min后開始提取。每個濃度水平設5個平行，隨機取3日進行測定，計算平均回收率、日內相對標準偏差(RSD)和日間RSD。結果表明，QCT，BDQCT，MQCA，CYA，BDCYA和QCA在不同樣品組織中3個加標水平下的平均回收率為76.3%～94.2%，日內RSD為4.2%～10.9%，日間RSD為7.2%～11.7%，表4列出了不同基質樣品中6種待測物的回收率數(shù)據(jù)。該方法穩(wěn)定可靠，可滿足殘留分析方法的要求。

表4 不同組織中6種待測物的回收率及相對標準偏差

(續(xù)表4)

SampleAnalyteAdded(μg/kg)Recovery/%(n=5)Intra?RSD/%(n=5)Inter?RSD/%(n=3)BDCYA5，10，50791，880，76673，70，76104，84，81QCA5，10，50785，854，88359，70，8172，84，94ChinesemittencrabQCT5，10，50777，776，78681，72，91100，100，93BDQCT5，10，50781，841，79378，79，7993，94，115MQCA5，10，50831，845，85467，99，7086，117，77CYA5，10，50793，799，822105，94，83112，111，86BDCYA5，10，50893，917，86167，73，7290，100，85QCA5，10，50909，872，90248，51，5786，91，75

2.8 實際樣品分析

3 結 論

本文采用HPLC-MS/MS法對水產(chǎn)品中殘留的喹烯酮和喹賽多及其主要代謝物進行檢測。方法采用乙酸乙酯-乙腈混合溶液、鹽酸溶液分別提取樣品中殘留的目標物，經(jīng)過MAX固相萃取柱凈化，并對流動相的配比進行了優(yōu)化，采用HPLC-MS/MS進行測定。在5～50 μg/kg加標水平內，方法的平均回收率為76.3%～94.2%，RSD為4.2%～11.7%，方法檢出限為0.5～1.6 μg/kg，定量下限為2.0～5.0 μg/kg。本方法具有重復性好、準確穩(wěn)定等特點，符合殘留分析方法的性能要求，適于質檢機構日常對水產(chǎn)品中喹烯酮和喹賽多及其主要代謝物殘留的確證檢測，而且本方法可同時檢測2種原型藥及其4種主要代謝物，與檢測單一原型藥物或單一代謝物的文獻報道相比，可以更準確更全面地監(jiān)測喹烯酮和喹賽多藥物的殘留。

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Research on the Residual Detection of Quinocetone,Cyadox and Their Main Metabolites in Aquatic Products by HPLC-MS/MS

GUO Xia*,SUN Jian-hua,SUN Zhen-zhong,LIU Jing-hua,HUANG Xue-ling,LIU Yun-lu,CHEN Lin

(Shanghai Fisheries Research Institute,Shanghai 200433,China)

A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(HPLC-MS/MS) method was established for the determination of the residual quinocetone(QCT),cyadox(CYA),bidesoxyquinocetone(BDQCT),methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic acid(MQCA),bidesoxycyadox(BDCYA) and quinoxaline-2-carboxylic acid(QCA) in aquatic products.Samples were extracted with acetonitrile-ethyl acetate(1∶1) and hydrochloric acid solution,then cleaned up on a MAX solid-phase extraction cartridge.The separation of QCA,BDQCT,MQCA,CYA,BDCYA and QCT was carried out on a Waters XBridge C18column using methanol,acetonitrile and 0.1% fomic acid as mobile phase.The identification of six analytes was performed by selective reaction monitoring in positive electrospray ionization,and the quantification was done by the external standard method.The calibration curves of six analytes were linear in the range of 2-500 μg/L.At the fortified levels of 5-50 μg/kg,the recoveries ranged from 76.3% to 94.2%,with RSDs of 4.2% to 11.7%.The limits of detection(LOD) were in the range of 0.5-1.6 μg/kg and the limit of quantitation(LOQ) were 2.0-5.0 μg/kg.The results showed that the method could be used to analyze simultaneously QCT,CYA and their metabolites residues in aquatic products.

aquatic products;quinocetone(QCT);cyadox(CYA);metabolites;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)

2016-03-10；

2016-07-10

上海市青年人才成長計劃(滬農(nóng)青字【2015】第3-10號)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.12.004

O656.63;S816.7

A

1004-4957(2016)12-1535-07

*通訊作者：郭 霞，碩士，工程師，研究方向：理化分析，Tel:021-65483215-669，E-mail:guoxia_great2013@126.com