阿迪拉·阿地江，蔡雯，姚華，馬琦

(1新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，烏魯木齊830011；2新疆醫(yī)科大學護理學院；3新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院代謝性疾病重點實驗室)

新疆維吾爾族人群中MTHFR、MTRR基因多態(tài)性與NAFLD的相關(guān)性

阿迪拉·阿地江1，蔡雯2，姚華1，馬琦3

(1新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，烏魯木齊830011；2新疆醫(yī)科大學護理學院；3新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院代謝性疾病重點實驗室)

目的 探討新疆維吾爾族人群5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)及甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)基因多態(tài)性與非酒精性脂肪肝(NAFLD)的相關(guān)性。方法 選取維吾爾族NAFLD患者325例作為NAFLD組，選擇健康體檢的維吾爾族居民304例作為非NAFLD組，對研究對象進行問卷調(diào)查、體格檢查以及血液生化指標的檢測。應用多重高溫連接酶檢測反應技術(shù)檢測兩組MTHFR 基因C677T、A1298C位點及MTRR基因A66G位點的多態(tài)性。采用Logistic多因素回歸法分析維吾爾族NAFLD與MTHFR 基因C677T、A1298C位點及MTRR基因A66G位點多態(tài)性的相關(guān)性。結(jié)果 兩組MTHFR 基因C677T、A1298C位點和MTRR基因A66G位點基因型及等位基因的分布差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。調(diào)整混雜因素后，Logistic 回歸分析顯示，MTHFR 基因A1298C基因位點在隱性模型下與NAFLD有相關(guān)趨勢(OR=2.023、P<0.05)，在其余加性模型和顯性模型的基因型分布差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。MTHFR 基因C677T位點、MTRR基因A66G位點的加性模型、顯性模型和隱性模型下的基因型分布差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。結(jié)論 新疆維吾爾族人群中MTHFR基因A1298C基因位點多態(tài)性與NAFLD的發(fā)生有關(guān)，AA基因型可能增加NAFLD的發(fā)病風險。

非酒精性脂肪肝；維吾爾族；新疆；基因多態(tài)性；亞甲基四氫還原酶；甲硫氨酸合成酶還原酶

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一種無過量飲酒史，以肝細胞脂肪變性和脂質(zhì)貯積為特征的臨床病理綜合征。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)是參與體內(nèi)葉酸代謝的關(guān)鍵酶。研究表明，MTHFR、MTRR基因的多態(tài)性影響著其編碼的酶活性，從而影響體內(nèi)葉酸及同型半胱氨酸的水平。同型半胱氨酸(Hcy)是一種含硫氨基酸，是蛋氨酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，肝臟是其主要的代謝場所。Hcy通過影響脂質(zhì)代謝，促進脂質(zhì)的堆積及脂肪肝的形成。新疆維吾爾族人群具有遺傳結(jié)構(gòu)及飲食習慣的特殊性，是NAFLD的高發(fā)人群，但該基因在維吾爾族NAFLD中的研究尚未有報道。2015年1月～2016年1月，我們對325例新疆維吾爾族NAFLD患者MTHFR、MTRR基因的多態(tài)性進行研究，探討新疆維吾爾族人群MTHFR、MTRR基因多態(tài)性與NAFLD的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年1月～2016年1月在新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院新入院的維吾爾族NAFLD患者325例作為NAFLD組(病例組)，其中男151例、女174例，年齡(42.89±9.57)歲。均經(jīng)腹部B超檢查確診NAFLD，NAFLD診斷參照2010年中華醫(yī)學會肝臟病學分會《非酒精性脂肪性肝病診斷指南(修訂版)》的診斷標準。納入標準：無飲酒史或折合飲酒量為男性<140 g/周或40 g/d，女性<170 g/周或20 g/d；肝臟B超或影像學診斷符合彌漫性脂肪肝的影像學診斷標準。排除標準：合并高血壓、2型糖尿病、惡性腫瘤、酒精性脂肪肝、藥物性脂肪肝、甲狀腺功能紊亂、自身免疫性肝病、病毒性肝炎、嚴重感染、惡性腫瘤及資料不全者等。選擇在新疆醫(yī)科大學體檢中心健康體檢的維吾爾族人群304例作為非NAFLD組(對照組)，其中男137例、女167例，年齡(42.44±10.06)歲。納入標準：B超檢查無脂肪肝且排除惡性腫瘤史、手術(shù)史、肥胖癥、高血壓、糖代謝異常、血脂代謝異常、高尿酸血癥。

1.2 基因多態(tài)性檢測方法 所有受試者禁食8 h以上，于次日清晨采集靜脈血2 mL，EDTA抗凝，充分混勻后-80 ℃保存。采用Omega基因組DNA試劑盒快速提取全血基因組DNA。應用多重高溫連接酶檢測反應技術(shù)(iMLDR)，多重PCR引物設計。MTHFR C677T rs1801131多態(tài)性位點引物序列：正義鏈5′-GACCATTCCGGTTTGGTTCTCC-3′，反義鏈5′-TGTCAGGAGTGTGCCCTGACCT-3′。MTHFR A1298C rs1801133多態(tài)性位點引物序列：正義鏈5′-CATGCCTTCACAAAGCGGAAGA-3′，反義鏈5′-CTCT-CTCTGCCCAGTCCCTGTG-3′。MTRR A66G rs1801394多態(tài)性位點引物序列：正義鏈5′-TGTGTGGGTATTGTTGCATTGTTTC-3′，反義鏈5′-ACGGCTCTAACCTTATCGGATTCA-3′。多重PCR產(chǎn)物純化(在10 μL PCR產(chǎn)物中加入5 U SAP酶和2 U Exonuclease Ⅰ酶，37 ℃溫浴1 h，然后75 ℃滅活15 min)；連接反應體系：10×連接緩沖液 1 μL、高溫連接酶 0.25 μL、5′連接引物混合液(1 μmol/L)0.4 μL，3′連接引物混合液(2 μmol/L)0.4 μL、純化后多重PCR產(chǎn)物2 μL、ddH2O 6 μL混勻；將連接產(chǎn)物上ABI 3730XL測序儀進行分型檢測，對MTHFR基因C677T rs1801131、A1298C rs1801133和MTRR基因A66G rs1801394多態(tài)性位點進行檢測。

2 結(jié)果

2.1Hardy-Weinberg平衡分析Hardy-Weinberg分析結(jié)果表明，MTHFR基因C677T、A1298C位點和MTRR基因A66G位點均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P均>0.05)。

2.2MTHFR基因C677T、A1298C和MTRR基因A66G位點基因型及等位基因的分布 兩組MTHFR基因C677T、A1298C和MTRR基因A66G位點基因型及等位基因的分布差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1～3。

2.3 維吾爾族NAFLD患者危險因素Logistic回歸分析MTHFR基因A1298C基因位點的AA基因型是NAFLD發(fā)病的危險因素(OR=2.023，P<0.05)，其余加性模型和顯性模型的基因型分布差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。MTHFR 基因C677T位點、MTRR基因A66G位點的加性模型、顯性模型和隱性模型下的基因型分布差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表4～6。

表1 兩組MTHFR基因C677T位點基因型及等位基因分布(例)

表2 兩組MTHFR基因A1298C位點基因型及等位基因分布(例)

表3 兩組MTRR基因A66G位點基因型及等位基因分布(例)

表4 維吾爾族NAFLD和C677T多因素非條件Logistic回歸分析

表5 維吾爾族NAFLD和A1298C多因素非條件Logistic回歸分析

3 討論

NAFLD的發(fā)生、發(fā)展涉及遺傳、環(huán)境和生活方式等多種因素。近年來，隨著生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)的改變，與肥胖癥、糖脂代謝紊亂相關(guān)的NAFLD發(fā)病率不斷上升。目前NAFLD發(fā)病機制尚未完全明確。新疆是個多民族聚集地區(qū)，遺傳背景、生存環(huán)境、生活方式和膳食習慣具有特殊性，使得其人群肥胖的流行狀況和特征與漢族人群不同，相對于當?shù)氐臐h族人群，維吾爾族NAFLD的患病率較高。

表6 維吾爾族NAFLD和A66G多因素非條件Logistic回歸分析

Hcy是一種含硫氨基酸，是蛋氨酸循環(huán)的正常代謝產(chǎn)物，體內(nèi)不能合成，是能量代謝和許多需甲基化反應的重要產(chǎn)物。Hcy通過影響脂質(zhì)代謝，促進脂質(zhì)沉積及脂肪肝的形成，其中85%的Hcy轉(zhuǎn)硫作用在肝臟進行，因而Hey的代謝異常容易導致肝臟損傷。多種慢性肝臟損傷的情況均可以出現(xiàn)Hcy水平升高。Pogribny等[1]研究發(fā)現(xiàn)，蛋氨酸相關(guān)基因缺乏的小鼠Hcy水平明顯升高，而這些小鼠易發(fā)生脂類代謝異常。

MTHFR及MTRR均是葉酸 Hcy代謝過程中的關(guān)鍵酶。MTHFR不可逆地將5,10-亞甲基四氫葉酸(5,10-CH2-THF)還原為5-甲基四氫葉酸(5-CH2-THF)。MTHFR基因多態(tài)性導致的酶活性降低是Hcy水平升高的危險因素。MTRR是葉酸-Hcy代謝過程中的另一關(guān)鍵酶，以維生素B12為輔酶參與Hcy復甲基化為甲硫氨酸的過程。MTRR基因發(fā)生變異可能會引起血漿Hcy水平升高。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的MTHFR基因有多種突變型，不同的突變型對MTHFR的酶活性和熱穩(wěn)定性產(chǎn)生不同的影響，其中常見的突變有以下幾種： ①677C→T。是MTHFR最常見的突變位點，是第677位密碼子胞嘧啶(C)被胞嘧啶(T)置換，從而使編碼的丙氨酸被纈氨酸替代，導致MTHFR基因的熱穩(wěn)定性降低，使酶活性降低，從而引起Hcy升高[2,3]，引起NAFLD。Christensen等[4]研究發(fā)現(xiàn)，歐洲人群MTHFR基因C677T等位基因的頻率為22%～44%。在亞洲人中，日本人C677T等位基因頻率為34%[5]。于佳梅等[6]研究發(fā)現(xiàn)，中國漢族人C677T等位基因頻率為40%，認為亞洲人突變頻率偏高。陳紅華等[7]首次在國內(nèi)研究了MTHFR C677T基因多態(tài)性與NAFLD的相關(guān)性，并證實MTHFR C677T基因多態(tài)性是NAFLD的危險因素。② A1298C突變。此點突變位于第7外顯子的1298位點，為一個胞嘧啶取代腺嘌呤，從而使基因編碼的谷氨酸被丙氨酸替換[8]。 對MTHFR基因A1298C突變頻率在人群中的分布研究顯示，亞洲人群中的基因頻率為17%～19%，歐洲為27%～36%。Yang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，中國南方漢族人群A1298C多態(tài)性基因的基因頻率均低于新疆地區(qū)漢族人群。Sun等[10]經(jīng)Meta分析證實，MTHFR基因的A1298C是NAFLD發(fā)病的危險因素。而Benan[11]等研究未能證實此位點與NAFLD有相關(guān)性，所以此位點與NAFLD的相關(guān)性還需進一步探討。MTRR基因錯義突變是引起此酶缺乏或活性降低的主要機制，其中基因多態(tài)性研究較多的是第66位點腺嘌呤到鳥嘌呤突變導致的蛋氨酸被異亮氨酸替代，是該酶的活性降低從而引起體內(nèi)Hcy水平升高[12]，從而導致NAFLD的發(fā)生，在中國人群中研究甚少，平均基因頻率為28%～31%。在歐洲基因頻率為56.0%、南美洲為26.1%，亞洲為28.0%[13]。對于MTHFR及MTRR基因多態(tài)性與NAFLD的關(guān)系在國內(nèi)外研究甚少。

本研究發(fā)現(xiàn)，兩組MTHFR 基因C677T、A1298C位點和MTRR A66G基因位點基因型及等位基因的分布差異無統(tǒng)計學意義，在MTHFR 基因A1298C基因位點的隱性模型中有統(tǒng)計學意義，AA基因型在NAFLD的發(fā)生過程中是風險因素，而在MTHFR C677T和MTRR A66G基因型均無統(tǒng)計學意義，提示MTHFR A1298C基因中的AA基因可以增加NAFLD發(fā)生率，可作為預測維吾爾族NAFLD的重要評估指標之一。由于本研究僅限于新疆維吾爾族常駐人口，樣本具有局限性并且樣本量較少，加之目前對維吾爾族人群MTHFR基因與MTRR基因的研究較少，本研究的結(jié)論尚需更大樣本量的流行病學調(diào)查進一步驗證。

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Correlations between MTHFR and MTRR gene polymorphisms and NAFLD in Uygur population of Xinjiang

AdilaAdijiang1,CAIWen,YAOHua,MAQi

(CollegeofPublicHealth,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Objective To investigate the correlations between the methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) and methionine synthase reductase (MTRR) gene polymorphisms and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) in Uygur populations from Xinjiang. Methods Totally 325 Uygur patients with NAFLD (NAFLD group) and 304 healthy controls from physical checkups were selected. Questionnaire survey, physical examination and detections of blood biochemical indexes were conducted. The gene polymorphisms of MTHFR C677T and A1298C and MTRR A66G in the two groups were detected by improved multiple ligase detection reaction. The correlations between NAFLD and gene polymorphisms of MTHFR C677T and A1298C and MTRR A66G in Uygur populations from Xinjiang were analyzed by multivariate Logistic regression. Results No significant difference was found in the genotype and allelic distribution of MTHFR C677T and A1298C and MTRR A66G between the NAFLD and the control group (P>0.05). After adjusting confounding factors, an association of MTHFR A1298C with NAFLD was observed in the recessive model (OR=2.023,P<0.05), while in the additive and dominant models, no statistically significant difference was found (P>0.05). No statistically significant difference was found in the genotype distribution of MTHFR 677T and MTRR A66G in the additive model, dominant model and recessive model (P>0.05).Conclusion The gene polymorphism of MTHFR A1298C is associated with the occurrence of NAFLD in Xinjiang Uygur population and AA genotype may increase the risk of NAFLD.

non-alcoholic fatty liver disease; Uygur nationality; gene polymorphisms; methylenetetrahydrofolate reductase; methionine synthase reductase

國家自然科學基金資助項目(81460120)。

阿迪拉·阿地江(1988-)，女，在讀碩士研究生，主要研究方向為基因疾病與健康。E-mail: 505335248@qq.com

簡介：姚華(1959-)，男，博士，教授，主要研究方向為基因疾病與健康。E-mail: yaohua01@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.46.005

R575.2

A

1002-266X(2016)46-0020-04

2016-08-31)