郭志芳，田懷東

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

滹沱河沿岸野生大豆種子β-伴大豆球蛋白表型的多樣性

郭志芳，田懷東

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

山西省原平市境內(nèi)滹沱河沿岸分布有大量野生大豆。野生大豆種子蛋白質(zhì)類型豐富，是重要的蛋白質(zhì)資源。大豆種子蛋白質(zhì)主要包括β-伴大豆球蛋白（7S球蛋白）和11S球蛋白，其中，β-伴大豆球蛋白主要由76 kD的α′，72 kD的α和52～54 kD的β亞基組成。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）技術(shù)，篩選400份滹沱河沿岸野生大豆種質(zhì)，發(fā)掘出5種關(guān)于β-伴大豆球蛋白的系列表型：對(duì)照型、α′亞基分子量偏高型、α′亞基分子量偏低型、β亞基上位缺失型、β亞基缺失型。結(jié)果表明，滹沱河沿岸野生大豆種子β-伴大豆球蛋白性狀的多樣性，揭示出野生大豆種子β-伴大豆球蛋白具有復(fù)雜的分子構(gòu)成和遺傳機(jī)制。

野生大豆；β-伴大豆球蛋白；多樣性

大豆種子是重要的蛋白質(zhì)資源，其蛋白質(zhì)的主要成分是β-伴大豆球蛋白（7S球蛋白）和11S球蛋白，占種子總蛋白含量的70%～80%[1]，對(duì)大豆蛋白的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)起著決定性作用。11S球蛋白由G1～G5亞基組成，分別由Gy1～Gy5基因所編碼。β-伴大豆球蛋白主要由76 kD的α′，72 kD的α和52～54 kD的β亞基組成，分別由聚合在大豆基因組6個(gè)位點(diǎn)上至少15個(gè)成員（CG-1～CG-15）的基因編碼而成。11S球蛋白在發(fā)育胚細(xì)胞的糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以約60 kD的前體多肽鏈被合成后，經(jīng)過翻譯后修飾與輸送過程，在PSV中被內(nèi)切為37～45 kD的酸性和18～20 kD的堿性多肽，形成11S六聚體形態(tài)。7S球蛋白前體在糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成后，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔內(nèi)形成立體構(gòu)造，經(jīng)由高爾基體被輸送到蛋白儲(chǔ)藏液泡（PSV）中，進(jìn)一步被加工成7S三聚體，最終都蓄積在液泡型蛋白體[2-5]。Teraishi等[6-7]研究認(rèn)為，α′，α和β亞基分別由Cgyl，Cgy2與Cgy3這3個(gè)不同的基因控制，而單一顯性基因scg-1控制著它們的蓄積。蓄積的β-伴大豆球蛋白約占大豆種子蛋白含量的30%左右，其生化性狀與理化性質(zhì)一定程度上決定著大豆蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[8-11]。為了全面開展大豆蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的遺傳育種研究，有必要發(fā)掘多樣的大豆蛋白質(zhì)遺傳資源。

我國(guó)是大豆種質(zhì)資源大國(guó)，保有大量的栽培和野生大豆種質(zhì)資源。這些種質(zhì)資源是可供多樣球蛋白遺傳資源發(fā)掘的有用素材。其中，野生大豆種質(zhì)資源在性狀多樣性、抗逆抗病性以及適應(yīng)性等方面，具有栽培大豆無可比擬的優(yōu)勢(shì)。野生大豆起源于我國(guó)，是國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)的野生植物資源。從北緯24°左右的廣東、廣西北部地區(qū)開始到北緯52°左右的黑龍江畔均有野生大豆的分布[12]。山西省原平市滹沱河流域野生大豆原生境保護(hù)區(qū)項(xiàng)目于2011年由農(nóng)業(yè)部正式立項(xiàng)[13]，成為國(guó)家級(jí)野生大豆資源保護(hù)區(qū)。該區(qū)域的野生大豆分布廣、數(shù)量多、密度大，主要分布于原平市區(qū)東北滹沱河沿岸。截至目前，對(duì)該區(qū)域野生大豆種子蛋白質(zhì)的遺傳多樣性研究還未見報(bào)道。

近年來，山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室啟動(dòng)了對(duì)原平市滹沱河沿岸野生大豆資源狀況及其原生態(tài)環(huán)境的調(diào)查研究。本研究采用SDS-PAGE技術(shù)，評(píng)價(jià)了該區(qū)域的400份野生大豆種質(zhì)資源，旨在發(fā)掘出關(guān)于β-伴大豆球蛋白的系列表型，為大豆蛋白營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的遺傳育種研究提供有用材料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

在山西省原平市滹沱河沿岸采集400份野生大豆（HTWS1～HTWS400）作為供試材料（表1）。這些材料的種子呈橢圓形，籽粒較小，多為黑色，也有棕色與黃褐色（圖1）。試驗(yàn)在山西大學(xué)進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 野生大豆種子全蛋白的提取參照Tian等[14]的方法提取種子全蛋白。從400份野生大豆種子中每份各取1粒洗凈、烘干，每份種子取1粒粉碎后放入離心管中并按一定比例加入適量的全蛋白提取緩沖液；在漩渦混合儀上振蕩混勻后，12℃，120～150 r/min條件下振蕩6 h；4℃，5 000 r/min條件下離心20 min后取上清液稀釋2.5倍備用。

1.2.2 野生大豆種子β-伴大豆球蛋白的提取參照Liu等[15]的方法，進(jìn)行β-伴大豆球蛋白的提取。對(duì)已通過全蛋白篩選發(fā)掘出的特異性代表材料進(jìn)行β-伴大豆球蛋白的提取。將種子粉碎后按一定比例加入正己烷連續(xù)脫脂2次后，在脫脂粉末中加入0.03 mol/L的Tris-HCl（pH值8.5），45℃下振蕩1 h；離心后取出上清液，沉淀在相同條件下重復(fù)提取，將2次提取的上清液混在一起；加入1 mol/L SBS至0.03 mol/L，混勻后調(diào)pH值至6.4，4℃靜置貯存過夜后離心，取離心后的上清液加入NaCl至0.25 mol/L，調(diào)pH值至5.5，室溫下振蕩0.5 h；離心后取上清液，加入等量的超純水混勻；再次離心后，取上清液調(diào)pH值至4.8，于冰浴中靜置，看到有沉淀析出后離心，去掉上清液；所得蛋白用超純水清洗后，用全蛋白提取液溶解備用。

1.2.3 SDS-PAGE分析參照文獻(xiàn)[12]的方法，用32%丙烯酰胺、0.8%甲叉雙丙烯酰胺制備凝膠，將上述提取好的全蛋白液適量加樣、電泳。用50%甲醇、10%冰乙酸、0.1%R-250的溶液進(jìn)行凝膠染色，用25%甲醇、10%冰乙酸的溶液脫色，電泳結(jié)束后進(jìn)行凝膠成像和圖像分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于種子全蛋白SDS-PAGE的原平市滹沱河沿岸野生大豆種質(zhì)的篩選

通過對(duì)400份野生大豆種子全蛋白進(jìn)行篩選，電泳結(jié)果如圖2所示。選取野生大豆種子β-伴大豆球蛋白主要亞基對(duì)應(yīng)條帶無缺失且染色程度相對(duì)均勻的種質(zhì)HTWS-176等作為對(duì)照，并發(fā)掘出具有5種β-伴大豆球蛋白多樣性表型的系列種質(zhì)資源:對(duì)照型、α′亞基分子量偏低型、α′亞基分子量偏高型、β亞基上位缺失型、β亞基缺失型。

從表2可以看出，大部分為對(duì)照型種質(zhì)，發(fā)生頻度最大，為96.25%；HTWS-386的α′亞基分子量偏低，HTWS-395的α′亞基分子量偏高，發(fā)生頻度最小，均為0.25%；HTWS-8，HTWS-86，HTWS-79，HTWS-163，HTWS-164的β亞基缺失，發(fā)生頻度為1.25%；HTWS-42，HTWS-65，HTWS-70，HTWS-96，HTWS-198，HTWS-241，HTWS-367，HTWS-368的β亞基上位缺失型，發(fā)生頻度為2%。供試材料中特異亞基多態(tài)性種質(zhì)發(fā)生的頻度較小，為了避免我國(guó)大豆蛋白質(zhì)資源多樣性的消失，有必要在分子水平上對(duì)大豆種質(zhì)種子蛋白質(zhì)性狀進(jìn)行更加全面的發(fā)掘。

表2 滹沱河沿岸野生大豆種質(zhì)β-伴大豆球蛋白的多樣表型

2.2 代表性野生大豆種質(zhì)種子β-伴大豆球蛋白性狀的表征

為了證實(shí)這些多樣帶型源于β-伴大豆球蛋白表征的多樣性，提取相關(guān)代表性種質(zhì)的種子β-伴大豆球蛋白進(jìn)行表型分析，獲得了具有與β-伴大豆球蛋白分子量對(duì)應(yīng)的5種蛋白質(zhì)帶型的多樣種質(zhì)（圖3）。結(jié)果表明，野生大豆種質(zhì)種子β-伴大豆球蛋白在亞基組成上具有的多樣性與全蛋白顯示的多樣性一致。進(jìn)一步使用凝膠成像系統(tǒng)及圖像分析軟件對(duì)β-伴大豆球蛋白進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)對(duì)照種質(zhì)中α′亞基分子量為76 kD，而HTWS-395的α′亞基分子量為77.4 kD，HTWS-386的α′亞基分子量為75.2 kD。對(duì)照種質(zhì)中β亞基相對(duì)含量為27%，而HTWS-8的β亞基相對(duì)含量為0，HTWS-42的β亞基相對(duì)含量12.5%。這些結(jié)果可以得出，HTWS-395具有α′亞基分子量偏高、HTWS-386具有α′亞基分子量偏低，HTWS-8具有β亞基缺失，HTWS-42具有β亞基上位缺失的突變性狀。

3 討論與結(jié)論

從大豆種質(zhì)資源中發(fā)掘具有不同球蛋白性狀的種質(zhì)是大豆蛋白質(zhì)遺傳資源開發(fā)的有效途徑。郭順堂等[16]研究發(fā)現(xiàn)了β亞基缺失的大豆品種。Hajika等[17]報(bào)道了β-伴大豆球蛋白中α′，α和β亞基全部缺失的大豆種質(zhì)。Takahashi等[18-19]發(fā)現(xiàn)了α′和α亞基缺失的種質(zhì)，還發(fā)現(xiàn)了α亞基和β亞基的表達(dá)量減少的種質(zhì)材料。本研究從400份滹沱河沿岸原生態(tài)野生大豆種質(zhì)資源中發(fā)掘出5種大豆球蛋白表型，分別為：對(duì)照型、α′亞基分子量偏低型、α′亞基分子量偏高型、β亞基上位缺失型、β亞基缺失型。這些表型的變化可能起因于調(diào)控β-伴大豆球蛋白合成或蓄積的基因突變。表明大豆球蛋白具有復(fù)雜的分子構(gòu)成及遺傳機(jī)制，指出原平市滹沱河沿岸野生大豆種子球蛋白性狀的遺傳多樣性。本研究結(jié)果有望為闡明調(diào)控β-伴大豆球蛋白性狀表達(dá)的遺傳機(jī)制及大豆蛋白營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的遺傳育種研究提供借鑒。

［1］MengXX.Summarization about breedingofsoybean qualification[J].Chinese Agricultural Science Bulletin，1992，8（2）：14-17.

［2］Barton K A，Thompson J F，Madison J T，et al.The biosynthesis and processing of high molecular weight precursors of soybean glycinin subunits[J].Journal of Biological Chemistry，1982，257（11）：6089-6095.

［3］Dickinson CD，Hussein E H，Nielsen NC.Role ofpost-translational cleavage in glycinin assembly[J].The Plant Cell，1989，1（4）：459-469.

［4］Okita T W，Rogers J C.Compartmentation of proteins in the endomembrane systemofplant cells[J].Annual Reviewof Plant Biology，1996，47（1）：327-350.

［5］Utsumi S，Kitagawa S，Katsube T，et al.Synthesis，processing and accumulation of modified glycinins of soybean in the seeds，leaves and stems of transgenic tobacco[J].Plant Science，1993，92（2）：191-202.

［6］Teraishi M，Takahashi M，Hajika M，et al.Suppression of soybean β-conglycinin genes bya dominant gene，Scg-1[J].Theoretical and Applied Genetics，2001，103（8）：1266-1272.

［7］Kitamura K.Genetic improvement of nutritional and food processing quality in soybean[J].Japan Agricultural Research Quarterly，1995，29：1-11.

［8］Krivoruchco D，Kaba H，Sambucetti ME，et al.Maturation time and some seed composition characters affecting nutritive value in soybean varieties[J].Cereal Chemistry，1979，56：217-219.

［9］Murphy P A，Chen H P，Hanck C C，et al.Soybean storage protein composition and tofu quafity[J].Food Technology，1997，51：86-88.

［10］MurphyP A，Resurreceion A P.Varietal and environmental differences in soybean glycinin and β-conglycinin content[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1984，32：911-915.

［11］Cai T，Chang K C.Processing effect on soybean storage proteins and their relationship with tofu quality[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47：720-727.

［12］原平市農(nóng)業(yè)委員會(huì).山西省原平市滹沱河流域野生大豆原生境保護(hù)區(qū)項(xiàng)目簡(jiǎn)介[J].農(nóng)業(yè)工程技術(shù)：新能源產(chǎn)業(yè)，2013，34（11）：15.

［13］李福山.中國(guó)野生大豆資源的地理分布及生態(tài)分化研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1993，26（2）：47-55.

［14］Tian H D，Satoh H，Takemoto Y.Inheritance of novel 57H mutations in rice and their effect on compartmentation of endosperm storage proteins[J].International Journal of Plant Sciences，2004，165（4）：537-544.

［15］Liu C，Wang H L，Cui Z M，et al.Optimization of extraction and isolation for 11S and 7S globulins of soybean seed storage protein [J].Food Chemistry，2007，102：1310-1316.

［16］郭順堂，孟巖，張雪梅，等.中國(guó)大豆蛋白亞基構(gòu)成分析與缺失部分亞基的特異大豆品種的篩選[J].作物學(xué)報(bào)，2006，32（8）：1130-1134.

［17］Hajika M，Takahashi M，Sakai S，et al.Dominant inheritance of a trait lacking β-conglycinin detected in a wild soybean line[J]. BreedingScience，1998，48（4）：383-386.

［18］Takahashi K，Banaba H，Kikuchi A，et al.An induced mutant line lacking the α-subunit of β-conglycnin in soybean[J].Breeding Science，1994，46：251-255.

［19］Ladin B R，Doyle J J，Beachy R N.Molecular characterization of a delection mutation affecting the α'subunit of β-conglycnin of soybean[J].Molecule Applied Genetics，1984，2：372-380.

Diversity of Phenotypes of β-conglycinin in Seeds of the Wild Soybeans along the Hutuo River

GUOZhi-fang，TIANHuai-dong
（College ofLife Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

The wild soybeans along the Hutuo River located in Yuanping city of Shanxi province are important protein resources. The main components ofsoybean seed proteins include β-conglycinin（7S globulin）and 11S globulin.β-conglycinin mainly consists of α′subunit of76 kD,α subunit of72 kD and β subunit of52-54 kD.In this study,5 types phenotypes of β-conglycinin,the control type of β-conglycinin,high molecular weight of α′subunit,low molecular weight of α′subunit,upper lacked type of β subunit and lacked type of β subunit,are sought performing SDS-PAGE technique,by analysising 400 wild soybeans germplasms along Hutuo River.The results indicate that the diversityphenotypes ofβ-conglycinin in seeds ofwild soybeans alongthe HutuoRiver and reveale the complexity for molecular-composition and genetic-mechanismofβ-conglycinin in seeds ofwild soybeans.

wild soybean;β-conglycinin;diversity

S565.1

A

1002-2481（2016）04-0452-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.04.07

2016-01-29

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20130311006-3）

郭志芳（1990-），女，山西朔州人，在讀碩士，研究方向：植物種質(zhì)創(chuàng)新。田懷東為通信作者。