季天榮，何綺霞，殷秋妙，林雪賢，續(xù) 倩

（廣東省農業(yè)科學院農產品公共監(jiān)測中心，農業(yè)部農產品質量安全風險評估實驗室（廣州），廣東廣州510640）

動物性飼料原料及其飼料產品中揮發(fā)性鹽基氮測定方法的優(yōu)化

季天榮，何綺霞，殷秋妙，林雪賢，續(xù) 倩

（廣東省農業(yè)科學院農產品公共監(jiān)測中心，農業(yè)部農產品質量安全風險評估實驗室（廣州），廣東廣州510640）

選擇魚粉、肉骨粉、血粉及中華鱉配合飼料4種飼料產品為研究對象，分別采用水溶液和0.1，0.6，1.2mol/L的高氯酸溶液進行提取，并采用凱氏定氮法測定樣品提取液中揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）的含量，根據(jù)不同提取方法和蒸餾條件對測定結果的影響，對不同提取方法的關鍵參數(shù)進行優(yōu)化。同時選擇不同動物性飼料原料及其不同配比的配合飼料為研究對象，確定該測定方法的適用范圍。結果表明，以0.6mol/L高氯酸溶液為提取液，低溫振蕩提取30 min后測定4種飼料產品中TVB-N的含量，樣品加標回收率及變異系數(shù)均符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規(guī)范 食品理化檢測規(guī)程》規(guī)定的技術要求，且該方法所得結果與GB/T 5009.44—2003蒸餾法相比差異不顯著，操作簡便、快速。

動物性飼料；揮發(fā)性鹽基氮；測定方法

揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）是衡量動物性蛋白質飼料新鮮度的理化指標，是由于細菌的生長繁殖和酶的作用，使蛋白質分解而產生胺類以及氮等具有揮發(fā)性的堿性含氮物質[1-4]。其值是用于評價動物性飼料新鮮度的理化指標之一。已使用該指標在飼料行業(yè)中進行評估動物性飼料原料及其飼料產品的新鮮度，并已在魚粉、肉骨粉、血粉等飼料原料的國家標準中規(guī)定了揮發(fā)性鹽基氮的限量值，然而，卻缺乏其相應的檢測方法標準。因飼料有其特異性，其成分不同于肉與肉制品或產品，若使用肉與肉制品衛(wèi)生標準中的分析方法GB/T 5009.44—2003或水產品行業(yè)標準SC/T 3032—2007[5]對飼料樣品進行檢測，會造成一定的檢測誤差。

為了使飼料行業(yè)對揮發(fā)性鹽基氮的測定有據(jù)可依，從而保證飼料產品質量、維護飼料產品質量安全和人類健康，本研究對相應的飼料中揮發(fā)性鹽基氮的測定方法進行優(yōu)化。

1 材料和方法

1.1 材料及儀器試劑

1.1.1 試驗樣品 魚粉、肉骨粉、血粉及中華鱉配合飼料，全部由廣東省農業(yè)科學院農產品公共監(jiān)測中心提供。

1.1.2 儀器 樣品粉碎機或研缽；分樣篩（孔徑0.45 mm）；分析天平（感量0.1 mg）；低速離心機；半微量定氮裝置；錐形瓶250 mL；容量瓶50 mL；半自動定氮儀。

1.1.3 試劑 研究所用試劑均為分析純。水符合GB/T 6682—2008中三級用水的要求。高氯酸溶液（0.6 mol/L），氫氧化鈉溶液（40 g/L），鹽酸標準溶液（0.01 mol/L），硼酸吸收液（10 g/L），硅油消泡劑，甲基紅指示劑（10 g/L）以及混合指示劑（現(xiàn)用現(xiàn)配，甲基紅0.1%乙醇溶液與溴甲酚綠0.5%乙醇溶液等體積混合）。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集和制備 按照GB/T 14699.1—2005抽取有代表性的飼料樣品，用四分法縮減取樣，按照GB/T 20195—2006制備樣品，粉碎后過0.45mm孔徑的分析篩，混勻，裝入磨口瓶中備用。1.2.2 樣品處理 稱取試樣5 g（精確至0.1 mg）于錐形瓶中，加入高氯酸溶液（0.6 mol/L）40 mL，振蕩30 min，將試樣及試樣浸提液完全轉移至50 mL容量瓶，并用高氯酸溶液（0.6 mol/L）定容，搖勻；取約30 mL試樣浸提液于50 mL離心管中，3 500 r/min離心5 min，取上清液于2～6℃條件下貯存，可保存24 h。

1.2.3 蒸餾滴定 錐形瓶內加入硼酸（10 g/L）30mL、混合指示劑2～3滴；置于冷凝管下端，并使其下端插入吸收液的液面下。準確吸取浸提上清液10.00mL置消煮管內，同時加入氫氧化鈉溶液（40g/L）10mL，蒸餾。當吸收液體積達到150mL時，降下錐形瓶，用少量蒸餾水沖洗冷凝管末端至錐形瓶中。用鹽酸標準溶液（0.01 mol/L）滴定至吸收液由藍綠色變?yōu)榛壹t色，即為終點。同時，用高氯酸溶液（0.6mol/L）進行空白試驗。

2 結果與分析

2.1 高氯酸溶液濃度的選擇

研究比較了水溶液和不同濃度高氯酸溶液（0.1，0.6，1.2mol/L）對魚粉、血粉和中華鱉配合飼料中揮發(fā)性鹽基氮的提取效果，其結果如表1所示。

表1 提取劑濃度對揮發(fā)性鹽基氮含量測定的影響

由表1可知，水浸提液的pH值為5～6，隨著高氯酸溶液濃度的增加，樣品浸提液的pH值逐漸降低；以水溶液提取的飼料中的TVB-N含量高于以不同濃度高氯酸溶液提取的TVB-N含量。說明水溶液提取時，樣品浸提液可能存在微生物繼續(xù)腐敗的發(fā)生，隨著高氯酸溶液濃度的增加，樣品浸提液pH值逐漸降低，可能存在的微生物繼續(xù)腐敗受到抑制，TVB-N值呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。但提取試劑濃度為0.6 mol/L與1.2 mol/L樣品提取液pH值均在2.0以下，且測定的TVB-N含量比較穩(wěn)定，說明TVB-N的提取達到了很好的效果。但從實驗室安全性角度考慮，本研究選擇0.6mol/L高氯酸溶液作為提取劑。

2.2 樣品提取時間及提取方式的選擇

在確定了樣品提取劑及其濃度的基礎上，本研究繼續(xù)探討以0.6mol/L高氯酸溶液為提取劑，不同提取時間對飼料中TVB-N含量的影響（表2）。

表2 提取時間對飼料中揮發(fā)性鹽基氮含量的影響

由表2可知，隨著提取時間的增加，所測得的各飼料中TVB-N的含量有增加的趨勢。提取時間為30，45 min與提取10 min相比，所測測得魚粉、血粉及中華鱉配合飼料中TVB-N含量均比較穩(wěn)定，且差異較小。此外，本試驗以中華鱉配合飼料樣品為提取對象，對比了過濾和離心2種提取方式的差異，結果發(fā)現(xiàn)，采用過濾的方式進行提取時，浸提液幾乎無法過濾，其原因可能是因為其中含有制粒黏結劑的緣故，該類黏結劑遇到酸或水后，糊化度提高，黏結性增強，不易濾過；而采用離心方式進行提取，則可以快速得到樣品浸提上清液。因此，本試驗結果認為，選擇0.6mol/L高氯酸溶液提取30min，且采用離心提取上清液的方式，可滿足飼料中揮發(fā)性鹽基氮含量的測定要求。

2.3 樣品提取液的穩(wěn)定性

揮發(fā)性鹽基氮作為衡量飼料產品新鮮度的指標之一，及時對被檢樣品進行處理，并保證樣品提取液的穩(wěn)定性極其重要。由2.1可知，當以0.6mol/L高氯酸溶液為提取劑時，樣品提取液的pH值已降低到2.0以下，大部分微生物的活動已基本停止，但仍不能排除可能有少數(shù)耐酸微生物及其他環(huán)境條件的影響，因此，為了測定樣品提取液的穩(wěn)定性，試驗對樣品提取液在2～8℃存放條件下的存放時間進行對比試驗（表3）。

由表3可知，隨著樣品提取液放置時間的延長，3種飼料的TVB-N含量均有增加的趨勢。其中，與4 h相比，中華鱉配合飼料的提取液在放置48 h時，其TVB-N含量的增幅最大，不能滿足本試驗重復性要求。因此，本試驗認為，樣品提取液的放置時間以不超過24 h為宜。

表3 樣品提取液放置時間對飼料中TVB-N含量的影響 mg/100 g

2.4 準確度和精密度

2.4.1 不同飼料樣品的硫酸銨-氮標準溶液的添加回收試驗 選擇魚粉、肉骨粉、中華鱉配合飼料和血球粉為研究對象，分別加入一定量硫酸銨-氮標準溶液（含氮量為1 mg/mL），測定添加硫酸銨-氮標準溶液前后，不同飼料樣品中的TVB-N含量及其重復性，并計算回收率和變異系數(shù)，結果表明，該方法的硫酸銨-氮標準溶液添加回收率和變異系數(shù)均符合分析要求（表4，5）。

表4 不同飼料樣品的硫酸銨-氮標準溶液的添加回收率及精密度

2.4.2 魚粉中其他有機胺類物質的添加回收試驗

目前，揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）是因為動物性產品中的蛋白質在酶和細菌的作用下，發(fā)生腐敗分解而產生一類堿性含氮物。如酪氨酸在脫氨酶作用下產生酪胺、組氨酸在組氨酸酶作用下脫氨產生組胺、三甲胺和二甲胺等。本試驗分別以磷酸組胺-N、酪胺鹽酸-N、三甲胺鹽酸鹽-N和鹽酸二甲胺-N為標準溶液（其含氮量為1 mg/mL），選擇100，150 mg/100 g共2個水平進行添加，測定魚粉中TVB-N含量的變異系數(shù)與回收率（表5）。

由表5可知，以磷酸組胺-N、酪胺鹽酸-N為標準溶液時，魚粉中TVB-N含量的添加回收率為0，表明磷酸組胺-N、酪胺鹽酸-N無法通過此方法蒸餾出來。當以鹽酸二甲胺-N為標準溶液時，魚粉中TVB-N含量的添加回收率分別為102.82%（變異系數(shù)為2.94%）和101.29%（變異系數(shù)為2.01%）；當以三甲胺鹽酸鹽-N為標準溶液時，魚粉中TVB-N含量的添加回收率分別為103.32%（變異系數(shù)為2.49%）和101.62%（變異系數(shù)為0.01%），說明三甲胺鹽酸鹽-N和鹽酸二甲胺-N在魚粉中的回收率（95%～105%）和實驗室內變異數(shù)系數(shù)（≤5.3%）均在GB/T 27404—2008規(guī)定的范圍內。

表5 魚粉中其他有機胺類物質的添加回收率

2.5 適用范圍的確定

本測定方法選擇具有不同動物性飼料原料配比的飼料產品，測定其揮發(fā)性鹽基氮的含量，試驗結果表明，該方法可適用于測定動物性飼料原料和以動物性飼料原料制成的飼料產品中TVB-N的含量（表6）。

表6 不同動物性飼料原料配比的飼料產品中TVB-N含量的測定結果

2.6 本試驗方法與現(xiàn)行國家、國際標準的差異性[6-9]

目前，我國現(xiàn)行測定揮發(fā)性鹽基氮的標準有GB/T 5009.44—2003和SC/T 3032—2007；歐盟于1995年頒布了149號決議（95/149/EC）《水產品中揮發(fā)性鹽基氮的限量標準及其測定方法》。本試驗參考了以上3個標準的前處理方法，并結合我國GB/T 27404—2008規(guī)定的技術要求及其他相關飼料產品標準技術要求等，并對其進行了優(yōu)化。與以上3個標準相比，本試驗方法的主要技術差異列于表7。

表7 與現(xiàn)行相關標準的主要技術差異比較

3 結論與討論

3.1 準確度與重現(xiàn)性

本試驗結果表明，優(yōu)化法在測定準確度和重復性方面都優(yōu)于國標蒸餾法（GB/T 5009.44—2003）。主要表現(xiàn)在：第一，在樣品處理時，優(yōu)化法選擇0.6 mol/L高氯酸溶液作為提取劑，低溫恒速振搖提取，不僅有效沉淀蛋白、減少干擾、得到澄清的pH值小于2.0的提取液，同時避免了因樣品顆粒不均勻或振搖不夠導致的提取不充分，進一步提高試驗結果的準確性和重復性。第二，在蒸餾時，國標法則采用弱堿性氧化鎂混懸液堿化，而本研究優(yōu)化法是以均勻的氫氧化鈉溶液進行堿化，有效防止了因試驗操作中不易吸取到均勻的氧化鎂混懸液導致試驗結果重復性低的發(fā)生[10-13]。

3.2 高氯酸溶液作為提取劑，可以延長提取液的放置時間

本試驗用高氯酸溶液作為提取劑，一方面，可以有效沉淀蛋白，有效防止樣品中蛋白質對測定結果的干擾；另一方面，其具有殺菌和抑菌作用，可有效防止細菌對樣液中蛋白質的分解。同時，試驗結果表明，用高氯酸提取的樣液在5℃放置24 h內進行測定，幾乎不影響測定結果[10]，有效克服了實驗室同時進行大量樣品測定時，因不能及時對樣品進行測定而導致測定結果準確性差的缺陷。

3.3 采用離心的方式進行提取，提高樣品提取效率

國標法采用過濾的方式進行提取，而本研究采用離心方式進行提取，不僅大大節(jié)約了試驗時間，同時也可有效防止因環(huán)境溫度過高導致樣品在提取過程中產生的進一步腐敗，從而保證試驗結果的準確性。

3.4 其他

本研究的優(yōu)化法增加了定容的操作步驟，保證了該測定方法的精密度和準確性達到GB/T 27404—2008的要求。此外，本試驗以磷酸組胺和酪胺鹽酸為標準物質測定其添加回收率為0，說明磷酸組胺和酪胺鹽酸無法通過該蒸餾法進行測定，揮發(fā)性鹽基氮應從方法學角度進行定義較為準確[13-15]。

綜上所述，應用本研究優(yōu)化法測定動物性飼料原料及其飼料產品中的揮發(fā)性鹽基氮含量，操作簡便、快速，有很高的準確度和精密度，適宜于大批量樣品的處理和檢測，值得在飼料行業(yè)中推廣使用。

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Optim izing on Determ ination M ethod of Total Volatile Basic Nitrogen in Animal Feeds and Its Feeding Products

JI Tianrong，HE Qixia，YINQiumiao，LINXuexian，XU Qian
（Laboratory ofAgricultural ProductQuality Safety Risk Evaluation（Guangzhou），Ministry ofAgriculture，Public Monitoring Center for Agricultural Product，Guangdong Academy ofAgricultural Sciences，Guangzhou 510640，China）

Four feeding products such as fishmeal,meat and bone meal,blood meas and formula feed for soft-shelled turtle were pretreated by differentconcentrationg perchloric acid（HClO4）solutions to extract the total volatile basic nitrogen（TVB-N）,whichwas determined by distillation.According to different extraction methods and the different distillation conditions for the influence of the determination results,this paperoptimized the key parametersofextractingmethod.At the same time,choosing differentanimal feedsand its feeding products as study objects,the suitable range of the determination method was determined.The results showed that the rescovery and CV value conformed to the technical requirements in GB/T 27404-2008"Criterion on quality control of laboratories-chemical testof food",by determinating the TVB-N in fourkindsof feed productsafter the sampleswere shocked for30 min in 0.6 mol/L HClO4solution and low temperature environment.The result of this method had no significant difference compared with the distillation in GB/T 5009.44-2003,and theoperationwaseasy and took shorter time.

animal feeds;TVB-N;determinationmethod

S816.17

A

1002-2481（2016）07-1015-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.07.29

2016-03-11

廣東省農業(yè)領域科技計劃項目（2013B020306001）

季天榮（1981-），女，山西長治人，助理研究員，主要從事飼料質量安全與動物營養(yǎng)研究工作。何綺霞為通信作者。