田 晶，刁紅亮，馬瑞燕

（1.呂梁學院生命科學系，山西離石033000；2.山西農業(yè)大學農學院，山西太谷030801）

玫煙色棒束孢侵染對煙粉虱成蟲體內不同酶活的影響

田 晶1，2，刁紅亮2，馬瑞燕2

（1.呂梁學院生命科學系，山西離石033000；2.山西農業(yè)大學農學院，山西太谷030801）

對玫煙色棒束孢侵染煙粉虱成蟲后其體內的保護酶（超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT））和解毒酶（谷胱甘肽S-轉移酶（GSTs）、羧酸酯酶（CarE））的活力進行測定。結果表明，玫煙色棒束孢侵染煙粉虱成蟲后，煙粉虱成蟲體內SOD，POD，CAT，GSTs和CarE活力都受到明顯影響；SOD，POD，CAT，GSTs和CarE活力在感病前期均有上升趨勢，且高于對照，在接菌48～60 h時酶活力達到最大，然后酶活力開始下降，至84 h時均顯著低于對照。可見，玫煙色棒束孢的侵染嚴重影響了煙粉虱正常的生理活動。

玫煙色棒束孢；煙粉虱成蟲；保護酶；解毒酶

玫煙色棒束孢（Isaria fumosorosea）廣泛分布在世界各地，因此，寄主范圍也相當廣泛，包括同翅目、雙翅目、鞘翅目等[1]。山西農業(yè)大學生物防治研究室在田間分離到1株玫煙色棒束孢菌株，經(jīng)過初步致病力測定，證明該菌對煙粉虱有較強的致病力[2]。

與大多數(shù)蟲生真菌一樣，玫煙色棒束孢的菌絲也要穿透寄主的體壁才能對寄主進行侵染。菌絲進入寄主血腔后，會遭到寄主防御系統(tǒng)的抵抗[3]。在逆境脅迫下，昆蟲體內的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等多種抗氧化酶含量會發(fā)生變化，以抵御外界的侵害[4-5]。谷胱甘肽S-轉移酶（GSTs）和羧酸酯酶（CarE）能參與許多分子的解毒機制，在保護組織抵御氧化侵害中起重要作用[6-7]。在之前的研究中，對玫煙色棒束孢侵染煙粉虱2齡若蟲后其體內酶活進行了測定[8]，玫煙色棒束孢同樣對煙粉虱成蟲有致病作用[2]。

為了進一步了解煙粉虱成蟲感染玫煙色棒束孢后體內酶的變化規(guī)律，揭示其與玫煙色棒束孢侵染的相關性，本研究對感染玫煙色棒束孢的煙粉虱成蟲體內保護酶和解毒酶的活性進行了測定，為進一步研究玫煙色棒束孢對煙粉虱的侵染機制奠定理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試菌株：玫煙色棒束孢（Isaria fumosorosea）IF-1106菌株。

供試昆蟲：煙粉虱（Bemisia tabaci）。

1.2 菌液制備及試蟲處理

菌液制備及成蟲取樣方法參照煙粉虱致病力測定方法[2]。玫煙色棒束孢孢子懸浮液濃度為1.0× 107個/mL。成蟲處理12 h后開始取樣，每12 h取樣一次，取共7次。

1.3 酶液制備

將100頭成蟲置于加有1mL 0.05mol/L PBS緩沖液研缽后，冰浴勻漿。勻漿液在4℃，12 000 r/min條件下冷凍離心20min，取上清液作為酶液。

1.4 酶活測定

1.4.1 超氧化物歧化酶（SOD）活力測定 其按略改進的Beauchamp等[9]的方法測定。3mL反應體系：2.2 mL 0.05 mol/L PBS緩沖液，0.3 mL 130 mmol/L Met溶液，0.3 mL 750 μmol/L NBT溶液，0.03 mL 10 mmol/L EDTA-Na溶液，0.12 mL 100 μmol/L核黃素溶液，酶液0.05 mL。將反應液置于25℃，4 000 lx光照下反應，30 min后用黑暗終止反應，在560 nm下測定OD值，重復3次[10]。酶活性大小以單位時間單位蛋白的OD560變化值（U/mg）來表示。

1.4.2 過氧化物酶（POD）活力測定 其測定參照Simon等[11]的方法并略加改動。首先取28 μL 30%的H2O2和19 μL的愈創(chuàng)木酚加入50 mL 0.05 mol/L PBS緩沖液（pH＝6.0），反應時取上述混合溶液1mL與50 μL酶液混合，5 min后終止反應。470 nm下測定5min前后的OD470值，以每分鐘單位蛋白OD470變化值（U/（mg·min））來表示酶活力大小。

1.4.3 過氧化氫酶（CAT）活力測定 其測定按李周直等[12]的方法略加改動。1mL反應液中含0.5mL 0.1 mol的H2O2和0.5 mL的酶液，對照以0.5 mL的PBS緩沖液代替酶液，30℃恒溫水浴10 min后加入0.5 mL 10%的H2SO4終止反應，用0.1 mol的KMnO4滴定剩余的H2O2，記錄消耗的KMnO4量。酶活性用每毫克蛋白在10 min內分解H2O2的量（mg）來表示。

1.4.4 谷胱甘肽S-轉移酶（GSTs）活力測定 其測定參照Habig[13]的方法，略有改動。3mL反應液中加入2.78 mL 0.05 mol/L PBS緩沖液，0.1 mL 0.02 mol的還原型谷胱甘肽和0.02mL 0.03mol/L的1-氯-2，4-二硝基苯和0.01 mL的酶液，在340 nm下記錄2min內OD值的變化。酶活性大小以單位時間單位蛋白OD340變化值（U/（mg·min））來表示。

1.4.5 羧酸酯酶（CarE）活力測定 其測定參照Stumpf等[14]的方法，略有改動。3.2 mL反應液中加入0.05 mol/L PBS緩沖液0.45 mL，3×10-4mol/L的α-乙酸萘酯1.8 mL，0.05 mL酶液，30℃恒溫水浴15 min后加入0.9 mL 1%的固藍B鹽終止反應，600 nm下測定OD值，重復3次。酶活性大小以單位時間單位蛋白OD600變化值（U/（mg·min））來表示。

1.4.6 酶液蛋白質含量測定 其參照Bradford[15]的方法，用考馬斯亮藍G-250方法測定各酶液中蛋白質的含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用成對數(shù)據(jù)t檢驗法分析同一時間下處理與對照間酶活，數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 玫煙色棒束孢侵染對煙粉虱成蟲體內SOD活力的影響

從圖1可以看出，玫煙色棒束孢接種處理的煙粉虱成蟲的SOD活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，而對照的SOD活力基本不變。接種60 h后，處理組的煙粉虱成蟲SOD活力達到最高，為301.77 U/mg，與對照組間差異顯著。此后，處理組SOD活力逐漸降低，至84 h時，SOD活力下降為114.90 U/mg。玫煙色棒束孢接種處理后，煙粉虱成蟲SOD活力呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，說明煙粉虱成蟲在感菌后，體內SOD活力迅速提高以增強抵御能力，但SOD活力達到一定值后，菌體的入侵對蟲體組織器官形成了干擾，影響昆蟲正常的生理活動，使其SOD分泌受到抑制，因此，酶活力開始下降。

2.2 玫煙色棒束孢侵染對煙粉虱成蟲體內POD活力的影響

由圖2可知，玫煙色棒束孢接種處理的煙粉虱成蟲的POD活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，而對照的POD活力基本上不變。接種48 h后，處理組的煙粉虱成蟲POD活力達到最高，為14.96U/（mg·min），與對照組間差異顯著。此后，處理組POD活力逐漸降低，至84 h時，POD活力下降為2.51U/（mg·min）。成蟲的POD活力呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，說明煙粉虱成蟲在受到玫煙色棒束孢的侵染后，體內的POD不斷變化以適應該菌的侵染，但到了侵染后期，可能由于玫煙色棒束孢菌絲的大量繁殖或產(chǎn)生一些毒素，POD的合成受到影響，從而使處理組酶活低于對照。

2.3 玫煙色棒束孢侵染對煙粉虱成蟲體內CAT活力的影響

從圖3可以看出，玫煙色棒束孢接種處理的煙粉虱成蟲的CAT活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，而對照的CAT活力基本上不變。接種48 h后，處理組的煙粉虱成蟲CAT活力達到最高，為4.87mg，與對照組間差異顯著。此后，處理組CAT活力逐漸降低，至84h時，CAT活力下降為1.95mg。CAT活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，說明在感病前期，其體內的CAT活力升高以消除毒害的影響，但在侵染后期，蟲體組織和物質的代謝受到了嚴重的影響，蟲體清除自由基的能力顯著下降。

2.4 玫煙色棒束孢侵染對煙粉虱成蟲體內GSTs活力的影響

從圖4可以看出，玫煙色棒束孢接種處理的煙粉虱成蟲的GSTs活性呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，而對照的GSTs活力基本保持不變。接種48 h后，處理組的煙粉虱成蟲GSTs活力達到最高，為2.61U/（mg·min），與對照組間差異顯著。此后，處理組GSTs活力逐漸降低，至84 h時，GSTs活力下降為0.56U/（mg·min）。GSTs活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在侵染前期，蟲體內的解毒酶活力增加，以維持正常的生理活動，在侵染后期，由于蟲體組織發(fā)生病變，蟲體解毒能力下降。

2.5 玫煙色棒束孢侵染對煙粉虱成蟲體內CarE活力的影響

從圖5可以看出，玫煙色棒束孢接種處理的煙粉虱成蟲的CarE活力呈現(xiàn)先升后降的趨勢，而對照的CarE活力基本上不變。接種48 h后，處理組的煙粉虱成蟲CarE活力達到最高，為0.52 U/（mg· min），與對照組間差異顯著。此后，處理組CarE活力逐漸降低，至84 h時，CarE活力下降為0.11 U/（mg·min）。CarE活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在侵染前期，蟲體內的解毒酶活力增加，以維持正常的生理活動，在侵染后期，由于蟲體組織發(fā)生病變，蟲體解毒能力下降。

3 結論與討論

本研究結果表明，和煙粉虱2齡若蟲一樣，煙粉虱成蟲的保護酶（SOD，POD，CAT）和解毒酶（GSTs，CarE）都受到玫煙色棒束孢侵染的影響。煙粉虱感染玫煙色棒束孢后，其體內SOD，POD，CAT，GSTs和CarE較正常蟲體都有不同程度的變化，說明感病煙粉虱體內SOD，POD，CAT，GSTs和CarE活性變化與玫煙色棒束孢的侵染有關。

昆蟲體內存在著抗氧化酶系統(tǒng)，在正常的條件下，SOD可以催化氧自由基變成H2O2，然后CAT和POD可將H2O2進一步催化變成H2O。通過這些反應可以消除昆蟲體內的自由基。但若抗氧化酶系統(tǒng)遭到破壞，打破了細胞內氧自由基的平衡，便會導致生物細胞內氧自由基的濃度升高，自由基超強的氧化能力將破壞生物功能分子，使細胞功能受到破壞[16-17]。本試驗結果表明，侵染前期，煙粉虱體內的3種保護酶活力迅速上升，被感染的煙粉虱體內的自由基有所增多，機體迅速啟動抗氧化酶系統(tǒng)來消除自由基；但到了侵染后期，煙粉虱體內的3種酶活力明顯降低，玫煙色棒束孢的侵染使蟲體內的抗氧化酶活性受到抑制，從而降低了對自由基的清除能力，這也許是導致煙粉虱感病死亡的重要原因之一。

谷胱甘肽S-轉移酶（GSTs）和羧酸酯酶（CarE）是昆蟲體內重要的解毒酶，其可以保護昆蟲免受亞致死劑量的殺蟲劑和其他毒素的危害。本研究結果表明，玫煙色棒束孢在侵染前期對蟲體的GSTs和CarE有短暫的誘導作用，因此，在前48 h，GSTs和CarE活力有所增加，隨著侵染時間的延長，蟲體組織器官受到菌絲的破壞，使解毒酶的分泌受到影響，正常的生理代謝失衡，因此，酶活力顯著下降。

綜上所述，玫煙色棒束孢侵染對煙粉虱成蟲體內保護酶和解毒酶活性均有明顯影響。本研究從生化方面解釋了玫煙色棒束孢對煙粉虱正常的生理活動的影響。今后還有必要通過石蠟切片和透射電鏡進一步了解玫煙色棒束孢對煙粉虱的入侵機制。

［1］Zimmermann G.The entomopathogenic fungi Isaria farinose（formerly Paecilomyces farinosus）and the Isaria fumosorosea species complex（formerly Paecilomyces fumosoroseus）：biology,ecology and use in biological control[J].Biocontrol Science and Technology， 2008，18（9）：865-901.

［2］田晶，梁麗，李新鳳，等.玫煙色棒束孢IF-1106菌株對煙粉虱的致病力[J].山西農業(yè)科學，2013（7）：728-731.

［3］張仙紅，王宏民，李文英，等.菜青蟲感染玫煙色擬青霉后血淋巴蛋白質含量及幾種保護酶活力的變化 [J].昆蟲學報，2006（2）：230-234.

［4］Fridovich I.Oxygen is toxic[J].Bioscience，1977，27（7）：461-462.

［5］姬蘭柱，王桂清，劉艷，等.細辛精油對2種農業(yè)害蟲保護酶和解毒酶活性的影響[J].河南農業(yè)科學，2013（12）：79-85.

［6］豆威，王進軍.昆蟲谷胱甘肽S-轉移酶研究進展[J].農業(yè)生物災害預防與控制研究，2005（1）：426-431.

［7］史翠紅，宋萍，王勤英，等.嗜線蟲致病桿菌殺蟲毒素對棉鈴蟲幼蟲幾種酶活性的影響[J].華北農學報，2007，22（3）：105-110.

［8］Tian J，Diao H L，Liang L，et al.Pathogenicity of Isaria fumosorosea to Bemisia tabaci，with some observations on the fungal infection process and host immune response[J].Journal of Invertebrate Pathology，2015，130：147-153.

［9］Beauchamp C，F(xiàn)ridovich I.Superoxide dismutase：Improved assays and an assay applicable toacrylamidegels[J].Analytical Biochemistry，1971，44（1）：276-287.

［10］蔣繼宏，吳薇，曹小迎，等.苦豆堿對楊小舟蛾體內保護酶系統(tǒng)活力的影響 [J].南京林業(yè)大學學報：自然科學版，2005（5）：91-93.

［11］Simon L M，F(xiàn)atraim Z，Jonas D E.Study of peroxide metabolism enzymes during the development of Phaseolus vulgaris[J].Biochemistry Physiology，1974，166：387-392.

［12］李周直，沈惠娟，蔣巧很，等.幾種昆蟲體內保護酶系統(tǒng)活力的研究[J].昆蟲學報，1994（4）：399-403.

［13］HabigW H.Assays for differentitation of glutathione S-transferase. In：Method in enzymology[M].New York：Academic Press，1981：398-405.

［14］Stumpf N，Nauen R.Biochemical markers linked to abamectin resistance in Tetranychus urticae（Acari:Tetranychidae）[J].Pesticide Biochemistryand Physiology，2002，72：111-121.

［15］Bradford M M.A rapid and sensitivemethod for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dyebinding[J].Analytical Biochemistry，1976，72：248-254.

［16］李毅平，龔和.昆蟲體內抗氧化系統(tǒng)研究進展 [J].生命科學，1998（5）：240-243.

［17］王宏民，張奐，郝赤，等.玫煙色棒束孢侵染對小菜蛾幼蟲體內不同酶活的影響[J].菌物學報，2013（2）：269-276.

Effects of Isaria fum osorosea Infection on Different Enzyme Activities in the Adult in vivo of Bem isia tabaci

TIAN Jing1，2，DIAOHongliang2，MA Ruiyan2
（1.Departmentof Life Sciences，Lüliang University，Lishi 033000，China；2.College ofAgronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

The activitiesofprotectiveenzyme（superoxide dismutase（SOD）,perioxidase（POD）,catalase（CAT））and detoxification enzyme（glutathione S-transferase（GSTs）,carboxylesterase（CarE））of adults of Bemisia tabaci infected by Isaria fumosorosea were studied.The results indicated that activities of SOD,POD,CAT,GSTs and CarE were significantly affected by Isaria fumosorosea.The activitiesofSOD,POD,CAT,GSTsand CarE increased after infection.These valueswere higher than control at the beginning of infection and reached their peaks in 48-60 h,then decreased and significantly lower than control in 84 h.Therefore,the physiological activities of Bemisia tabaci were disturbed by the infection of Isaria fumosorosea.

Isaria fumosorosea;adultof Bemisia tabaci;protectiveenzyme;detoxification enzyme

S433.39

A

1002-2481（2016）07-1007-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.07.27

2016-02-28

山西省煤基重點科技攻關項目（FT201402）；北京農學院農業(yè)部都市農業(yè)（北方）重點實驗室開放課題（KFK-2015001）；呂梁學院校內基金項目（ZRXN201409）

田 晶（1987-），女，山西浮山人，講師，博士，主要從事昆蟲生理與生物防治研究工作。馬瑞燕為通信作者。