段九菊，張 超，賈民隆，鄭梅梅，曹冬梅，康黎芳，王云山

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，山西太原030031；2.山西梅芝園藝有限公司，山西太原030025）

秋水仙素誘導(dǎo)矮牽牛四倍體的研究

段九菊1，張 超1，賈民隆1，鄭梅梅2，曹冬梅1，康黎芳1，王云山1

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，山西太原030031；2.山西梅芝園藝有限公司，山西太原030025）

用不同濃度的秋水仙素溶液對(duì)矮牽牛種子進(jìn)行浸漬處理。結(jié)果表明，以0.05%秋水仙素溶液浸漬處理誘變效果最好，變異株率及四倍體誘變率最高，分別達(dá)到29%，4.5%。經(jīng)染色體鑒定確定的四倍體植株較二倍體對(duì)照植株生長(zhǎng)緩慢、生育期延長(zhǎng)、開(kāi)花期延后，但生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、莖稈變粗、葉片變厚變大，花器官增大，葉片氣孔變大，氣孔密度減少，葉色深綠，葉綠素含量高于二倍體植株。

四倍體矮牽牛；誘變率；形態(tài)特征；氣孔；葉綠素

矮牽牛（Petunia hybrida Vilm.）為茄科矮牽牛屬植物，其花色豐富，花期長(zhǎng)達(dá)數(shù)月之久，適應(yīng)性強(qiáng)，管理簡(jiǎn)單，被喻為“世界花壇花卉之王”，又有花壇“皇后”之美稱。國(guó)外生產(chǎn)的矮牽牛主要以二倍體為主，近年來(lái)，歐美國(guó)家的育種工作者通過(guò)自然突變、人工誘導(dǎo)、常規(guī)雜交等方法獲得了大量大花、重瓣、花期長(zhǎng)、花色豐富的多倍體矮牽牛新品種。而我國(guó)目前花卉企業(yè)和農(nóng)戶生產(chǎn)的矮牽牛品種均為二倍體類(lèi)型，且存在一定的品種退化現(xiàn)象。

多倍體植物具有器官巨大性、抗性強(qiáng)、新奇變異等特征，是花卉育種中重要的種質(zhì)資源[1-3]。采用秋水仙素誘導(dǎo)獲得多倍體在茉莉[4]、卷丹[5]、紅掌[6]、風(fēng)信子[7]、百合[8-9]、彩色馬蹄蓮[10]、蘭花[11]等花卉上均有成功的報(bào)道。

本試驗(yàn)通過(guò)秋水仙素溶液浸漬矮牽牛種子處理，誘導(dǎo)獲得四倍體，并對(duì)所獲得的四倍體進(jìn)行形態(tài)特征和細(xì)胞學(xué)鑒定，以期為今后的矮牽牛多倍體育種提供依據(jù)及優(yōu)良的種質(zhì)資源，從而豐富和改善矮牽牛品種，提高其觀賞性。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料為浙江虹越花卉公司提供的矮牽牛雜交一代種子，品種名為探險(xiǎn)家紫色。

1.2 誘導(dǎo)方法

誘導(dǎo)方法為種子浸漬法，處理用藥液為秋水仙素溶液，濃度為0.05%，0.10%，0.15%，同時(shí)以蒸餾水為對(duì)照。秋水仙素處理方法為：將種子用清水浸種24 h，之后播于帶有濾紙的培養(yǎng)皿中，再用秋水仙素藥浸24 h，取出，充分水洗后用蒸餾水浸種24 h，之后放于25℃黑暗條件下發(fā)芽。待種子發(fā)芽后播于溫室泥炭土中。每濃度組處理矮牽牛種子數(shù)為200顆。

1.3 變異植株統(tǒng)計(jì)

將秋水仙素處理組的植株與對(duì)照組植株比較，將出現(xiàn)苗期生長(zhǎng)緩慢、葉片增厚增大皺縮、莖稈變粗、開(kāi)花延遲、花器官增大等形態(tài)特征的植株作為變異植株，統(tǒng)計(jì)變異株數(shù)，并計(jì)算變異株率。

1.4 變異植株細(xì)胞學(xué)鑒定

于8：30—9：30取白色飽滿根尖約1 cm，放入對(duì)二氯苯飽和溶液中浸泡5 h后，轉(zhuǎn)入卡諾固定液中，固定22 h，保存于70%酒精中。采用染色體常規(guī)壓片法制片[12]，Nikon顯微鏡觀察、計(jì)數(shù)并照相。觀察對(duì)照組及處理組變異植株的染色體數(shù)，確定其倍性，統(tǒng)計(jì)四倍體株數(shù)，計(jì)算四倍體誘變率。

1.5 二倍體與四倍體矮牽牛植株形態(tài)特征比較

將經(jīng)染色體鑒定的四倍體植株與對(duì)照組二倍體植株進(jìn)行比較。觀察記錄葉片形態(tài)特征（如葉長(zhǎng)、葉寬、葉片厚）及花器官形態(tài)特征（如花冠、花柄、花瓣、花柱、花藥、花萼等方面的變化），計(jì)算葉形指數(shù)（葉長(zhǎng)/葉寬）。采用印跡法[13]觀察氣孔開(kāi)張情況，計(jì)算氣孔關(guān)閉百分率。統(tǒng)計(jì)氣孔外橫徑、外縱徑、內(nèi)橫徑、內(nèi)縱徑、氣孔密度。

1.6 二倍體與四倍體矮牽牛植株葉片葉綠素含量比較

采用乙醇、丙酮、水混合液浸提法[14]測(cè)定二、四倍體矮牽牛植株葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度秋水仙素對(duì)矮牽牛的誘導(dǎo)效果比較

從表1可以看出，在0.05%～0.15%濃度的秋水仙素處理下，矮牽牛種子發(fā)芽數(shù)、出苗數(shù)、成活株數(shù)、變異株數(shù)、變異株率均隨濃度升高呈逐漸下降的變化趨勢(shì)，其中以0.05%秋水仙素種子浸漬處理誘變效果最好，變異株率最高，為29%。

表1 不同濃度秋水仙素誘導(dǎo)矮牽牛變異的效果

2.2 變異植株染色體鑒定

表2 不同濃度秋水仙素誘導(dǎo)四倍體矮牽牛的效果

試驗(yàn)對(duì)對(duì)照組矮牽牛植株及秋水仙素處理組所有變異矮牽牛植株進(jìn)行染色體鑒定，結(jié)果表明，對(duì)照組矮牽牛植株為二倍體（2n＝2x＝14，圖1-A），變異植株中有的為四倍體（2n＝4x＝28，圖1-B），有的為非整倍體（2n＝24，圖1-C），有的為不同倍性細(xì)胞嵌合的嵌合體。以0.05%濃度的秋水仙素處理四倍體誘變率最高，達(dá)到4.5%（表2）。

2.3 二倍體與四倍體矮牽牛氣孔比較

四倍體矮牽牛植株葉片下表皮氣孔增大，氣孔外縱徑、外橫徑較二倍體植株分別增加32.78%，10.10%，氣孔內(nèi)縱徑、內(nèi)橫徑較二倍體植株分別增加30.40%，17.59%，氣孔密度較二倍體植株減少60.0%，氣孔關(guān)閉百分率是二倍體的3.44倍（圖2，表3）。

表3 二倍體和四倍體矮牽牛氣孔比較

2.4 二倍體與四倍體矮牽牛形態(tài)學(xué)特征比較

與二倍體矮牽牛植株相比，經(jīng)秋水仙素誘變獲得的四倍體植株生長(zhǎng)緩慢、生育期延長(zhǎng)，但植株長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)于二倍體植株。莖稈變粗（圖3-H），葉片增厚、變大、皺縮、表面粗糙（圖3-G）。葉長(zhǎng)、葉寬、葉片厚分別較二倍體增加6.43%，13.07%，28.36%，葉形指數(shù)較二倍體降低7.41%（表4）。四倍體植株開(kāi)花比二倍體晚30～40 d，但花器官明顯大于二倍體（圖3-E，F(xiàn)），花徑較二倍體增加13.46%（表5），花筒長(zhǎng)較二倍體增加43.33%，花柄長(zhǎng)較二倍體增加22.22%，花瓣變厚、厚度較二倍體增加18.75%，有的變異植株花瓣邊緣皺褶、卷曲。花柱增長(zhǎng)，柱頭變大（圖3-A），花藥增長(zhǎng)增寬、體積增大（圖3-B）、花蕾體積增大（圖3-C）?；ㄝ嘁裁黠@增大（圖3-D），花萼長(zhǎng)和寬分別較二倍體增加31.6%和13.64%。

表4 二倍體與四倍體矮牽牛葉片比較

表5 二倍體與四倍體矮牽?；ㄆ鞴俦容^

由表6可知，四倍體矮牽牛植株葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素、類(lèi)胡蘿卜素含量及葉綠素a/b均高于二倍體矮牽牛植株。植株外觀形態(tài)上可見(jiàn)四倍體植株葉色明顯深于二倍體植株（圖3-G，I）。

表6 二倍體與四倍體矮牽牛葉綠素含量比較

3 結(jié)論

利用秋水仙素進(jìn)行染色體加倍具有經(jīng)濟(jì)、方便、誘變作用專(zhuān)一性強(qiáng)等特點(diǎn)[5，15]。本試驗(yàn)以0.05%濃度的秋水仙素溶液浸漬矮牽牛種子24 h誘導(dǎo)的變異株率及四倍體誘變率最高，分別達(dá)到29%及4.5%。誘導(dǎo)獲得的四倍體矮牽牛植株與正常植株相比，表現(xiàn)出生長(zhǎng)緩慢、生育期延長(zhǎng)、開(kāi)花期延后，但植株生長(zhǎng)勢(shì)增強(qiáng)，葉片增大增厚，葉形指數(shù)降低，莖稈變粗，花器官增大，花萼增大，葉色加深，葉綠素含量增加。葉片下表皮氣孔增大，但氣孔密度降低、氣孔關(guān)閉百分率增加。表明采用適宜濃度的秋水仙素誘導(dǎo)獲得花器官大、觀賞性更佳、適應(yīng)性更強(qiáng)的四倍體矮牽牛是一種有效的方法，但秋水仙素誘變后矮牽牛植株倍性變化較復(fù)雜，試驗(yàn)中除獲得了四倍體植株外，也獲得了一些非整倍體和嵌合體。對(duì)嵌合體加倍部位無(wú)性繁殖獲得純合的多倍體植株以及自交收獲種子是下一步的工作內(nèi)容。

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Study on Colchicine-induced Tetrap loid in Petunia hybrida Vilm.

DUAN Jiuju1，ZHANG Chao1，JIA Minlong1，ZHENG Meimei2，CAODongmei1，KANG Lifang1，WANG Yunshan1
（1.InstituteofHorticulture，Shanxi Academy ofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；2.Shanxi Meizhi Horticulture Limited Company，Taiyuan 030025，China）

Differentconcentrationsofcolchicine solutionwereused to soaking the seeds for polyploidy induction in Petunia hybrida Vilm..The results showed that the best effect of mutation was obtained with 0.05%colchicine solution.The frequencies of mutation and tetraploid were 29%and 4.5%,respectively.Compared with the normal diploid plants,the tetraploid plants showed slower growth rate, prolonged growth period and delayed flowering time.However,the tetraploid plants showed stronger growth potential,wider diameter of stem,and the increaseof the thicknessof leaves,the sizeof flowerorgans,and the sizeofstomata,and the stomata density decreased.The colorof leaveswasdarkerand the chlorophyll contentwashigher than thenormal diploid plants.

tetraploid in Petunia hybrida Vilm.;frequency ofmutation;morphological characteristics;stomata；chlorophyll

S681.6

A

1002-2481（2016）07-0951-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.07.14

2016-02-23

山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院育種基礎(chǔ)項(xiàng)目（Yyzjc1415）；山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20130311019-3）

段九菊（1981-），女，山西陽(yáng)城人，副研究員，博士，主要從事花卉栽培生理和遺傳育種研究工作。王云山為通信作者。