高玉琪，胡毓洪，梁 春，吳宗貴

基礎醫(yī)學

注射丹參多酚酸鹽對ApoE基因敲除小鼠血清TNF－α和IL－6的影響

高玉琪，胡毓洪＊，梁 春，吳宗貴

目的 觀察C57BL/6J ApoE基因敲除小鼠在丹參多酚酸鹽（salvianolate，SAL）干預下血清腫瘤壞死因子－α（Tumor necrosis factor－α，TNF－α）和白細胞介素－6（Interleukin－6，IL－6）的變化，探討SAL抗動脈粥樣硬化的可能機制。方法 給4周齡雄性C57BL/6J ApoE－/－小鼠（共40只）和C57BL/6J野生型小鼠（10只）分別行高脂飲食處理，采用腹腔注射給藥（1次/d，5次/w）方法，隨機將其分為4組，模型組10只，腹腔注射生理鹽水；丹參多酚酸鹽低劑量（60 mg/kg）組10只、中劑量（120 mg/kg）組10只、高劑量（240m g/kg）組10只和C57BL/6J野生型小鼠，即正常對照組10只。24 w末時處死各組小鼠，留取血清，采用特異性放射免疫法測定各組小鼠血清TNF－α和IL－6濃度。結果 24 w末時，模型組小鼠TNF－α和IL－6血清濃度明顯升高；丹參多酚酸鹽干預各組TNF－α和IL－6血清濃度均明顯低于模型組（P均＜0.05）；隨SAL濃度增加，各干預組TNF－α和IL－6血清濃度逐漸降低（P均＜0.05），但仍均高于正常對照組水平（P均＜0.05）。結論 SAL干預后ApoE－/－小鼠TNF－α和IL－6水平下降，說明其可能通過降低動脈粥樣硬化炎癥反應進程來發(fā)揮抗動脈硬化作用。

丹參多酚酸鹽；腫瘤壞死因子－α（TNF－α）；白細胞介素－6（IL－6）；ApoE－/－小鼠；放射免疫試驗

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）發(fā)病機制非常復雜。隨著炎癥細胞和炎癥介質的不斷檢出，AS不再被認為是單純的動脈壁脂質堆積，而是進展性炎癥反應性疾病，因此，Ross在其損傷反應學說的基礎上，明確提出“AS是一種炎癥性疾病”［1］。腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）和白細胞介素－6（interleukin－6，IL－6）是已經證實參與AS炎癥發(fā)病機制的重要促炎因子，能夠促進AS的發(fā)展；丹參是祖國傳統活血化瘀中藥，臨床應用廣泛，丹參多酚酸鹽（salvianolate，SAL）是從丹參中提取的水溶性有效成分，已有研究證實其具有抗氧化、抗氧自由基、降低細胞內游離鈣濃度、抗血小板聚集、改善微循環(huán)、抗血栓形成、促進內皮修復等多種作用［2］能抑制平滑肌細胞增殖和穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊［3］。SAL能否抑制ApoE－/－小鼠血清促炎因子TNF－α和IL－6水平則尚未見報道。筆者通過觀察SAL干預后C57BL/6J ApoE－/－小鼠血清TNF－α和IL－6水平的變化，探討其抗AS可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組和給藥 4周齡雄性C57BL/6J AopE－/－小鼠42只，普通飼料喂養(yǎng)2 w后給予高脂飲食（普通飼料+2%膽固醇+5%的豬油）喂養(yǎng)12 w后，隨機處死2只，取主動脈根部，HE染色普通光鏡下觀察，確定已形成動脈粥樣硬化斑塊后，將其余40只C57BL/6J AopE－/－小鼠隨機分成4組，即模型組（僅腹腔注射生理鹽水，10只）、丹參多酚酸鹽60 mg/ kg組（10只）、丹參多酚酸鹽120 mg/kg組（10只）、丹參多酚酸鹽240 mg/kg組 （10只），正常對照組（即C57BL/6J野生型小鼠）10只。注射用丹參多酚酸鹽100 mg溶于0.9%的氯化鈉注射液10 ml中，按以上不同劑量給予腹腔注射，1次/d，5次/w，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)至24周末。

1.2 藥品來源 注射用丹參多酚酸鹽由上海綠谷制藥有限公司生產，批號：070602，規(guī)格100 mg/支。

1.3 血液標本的采集 于實驗24 w末各組小鼠腹腔注射苯巴比妥鈉麻醉后（麻醉前禁食12 h）后摘取眼球，取血1.5 ml（處死動物前），立即以800 g/ min的速度離心10 min，留取血清于－70℃低溫冰箱中保存待測。

1.4 檢測方法 采用特異性放射免疫法測定各組血清TNF－α和IL－6水平，按試劑盒說明書操作。TNF－α和IL－6 RIA kit購自解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心免疫技術研究所。TNF－α RIA kit劑盒靈敏度：0.3 ng/ml；批內變異系數CV＜5%，批間CV＜8%；本抗血清與EPO、TGF、IL－2、IL－6、IL－10、IL－12均無交叉反應。IL－6 RIA kit試劑盒靈敏度：0.3 pg/ ml；批內變異系數CV＜5%，批間CV＜8%；本抗血清與EPO、TGF、IL－2、TNF－α、IL－8均無交叉反應。采用上海日環(huán)光電儀器有限公司SN－697型雙探頭γ計數儀測定各組小鼠血清TNF－α和IL－6濃度。

1.5 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件包進行統計學處理。實驗數據以（±s）表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較采用完全隨機設計的方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

C57BL/6J野生型小鼠飼養(yǎng)過程中死亡1只；模型組和SAL（60 mg/kg）組各死亡1只、SAL（120 mg/ kg）組和SAL（240 mg/kg）組各死亡2只。24周末，隨SAL劑量的增加，ApoE－/－小鼠血清濃度逐漸降低，SAL各劑量組血清TNF－α和IL－6濃度均低于模型組（P＜0.05）；SAL（60 mg/kg）組血清TNF－α和IL－6水平分別與正常對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；SAL（120 mg/kg）組血清TNF－α和IL－6水平明顯低于60 mg/kg組（P＜0.05），240 mg/kg組血清TNF－α和IL－6水平分別明顯低于 （120 mg/kg）組和（60 mg/kg）組（P均＜0.05），SAL（240 mg/kg）組IL－6水平仍分別明顯高于正常對照組水平 （P均＜0.05）。見表1。

表1 SAL對ApoE-/-小鼠血清TNF-α和IL-6濃度的干預作用（±s）

表1 SAL對ApoE-/-小鼠血清TNF-α和IL-6濃度的干預作用（±s）

與正常對照組比較＊P＜0.05，與模型組比較ΔP＜0.05，與SAL（60 mg/kg）組比較，#P＜0.05；與SAL（120 mg/kg）組比較，▲P＜0.05。

組別 n T N F－α（n g / m l） I L－6（p g / m l）正常對照組 9 1.0 9 ± 0.0 9 4 0.3 6 ± 1 1.5 3模型組 9 1.4 5 ± 0.1 2＊ 3 7 8.4 5 ± 6 6.8 1＊S A L（6 0 m g / k g）組 9 1.2 1 ± 0.0 6＊Δ 2 5 8.3 2 ± 5 3.1 9＊ΔS A L（1 2 0 m g / k g）組 8 0.8 2 ± 0.0 7＊Δ# 1 6 5.7 7 ± 3 0.0 3＊Δ#S A L（2 4 0 m g / k g）組 8 0.6 5 ± 0.0 8＊Δ#▲ 1 0 9.6 1 ± 2 7.1 8＊Δ#▲

3 討論

慢性炎癥反應貫穿炎癥性AS的整個過程，大量促炎細胞因子參與其中，形成復雜的網絡調節(jié)，并最終形成炎癥瀑布效應，加重血管內膜損傷，導致AS進展。在免疫炎癥反應過程中，血液中的單核－巨噬細胞、血管內皮細胞和平滑肌細胞能夠分泌多種促炎性細胞因子，如TNF－α和IL－6等，進一步促進AS局部炎癥反應；TNF－α和IL－6均可通過細胞內信號轉導機制刺激其他相關炎癥介質和細胞因子的基因轉錄增強，促進炎癥介質和細胞因子進一步釋放，使得信號轉導級聯反應炎癥信號不斷放大，促進更多的單核細胞聚集、浸潤，最終促使AS病變進展惡化［4］。

TNF－α是由巨噬細胞分泌的一種致炎性細胞因子，具有致炎性、引發(fā)細胞壞死和新生血管形成，促進內皮素的產生并引起血管內皮損傷，誘使血小板聚集和血栓形成，表現促AS形成作用。IL-6亦主要是由巨噬細胞分泌的一種重要的致炎性細胞因子，可引起血管炎癥反應，增加AS斑塊面積，是冠狀動脈性疾病的獨立危險因素。

由于AS是動脈管壁增厚變硬，失去彈性和管腔縮小的血管病，雖然對其發(fā)病機制進行了大量和長期研究，但仍未找到確切的發(fā)病機制。目前主要有4種學說：脂肪浸潤學說、血小板聚集和血栓形成學說、平滑肌細胞克隆學說和損傷反應學說等。由于AS發(fā)病機制復雜、病因多種多樣，決定了其藥物治療無特異性，必須從多方面、多角度、多層面來進行干預。目前有許多藥物對其干預治療，如擴血管、調脂、抗血小板聚集、溶栓和抗凝藥物等，但AS的發(fā)病率和AS引起的各種并發(fā)癥導致的病死率仍居高不下。因此，尋找有效藥物進行AS早期干預，是防治AS的主要和迫切目標。

SAL是采用現代科學技術從傳統中藥丹參中提取的水溶性有效成分，具有抗氧化、抗氧自由基和抗栓、抗血小板聚集、擴張冠狀動脈、改善心肌血流量［5-8］和降低全血高切黏度、全血低切黏度、紅細胞聚集指數、纖維蛋白原、增加紅細胞變形指數以改善微循環(huán)；抑制心肌損傷，保護缺血再灌注細胞等多重功效［9，10］。

筆者發(fā)現隨SAL腹腔注射劑量的增加，ApoE基因缺陷小鼠血清TNF-α和IL-6濃度逐漸降低，說明SAL具有降低AS易感小鼠血清重要的致炎細胞因子水平，且隨劑量的增加，降低更加明顯。因此，SAL可能通過減少AS斑塊炎癥反應過程，減少血管內皮損傷程度以延緩AS形成過程。

因此，SAL降低AS形成過程中重要致炎性細胞因子水平，以延緩AS發(fā)生和發(fā)展過程，可能是其抗AS多效性保護作用機制之一，可能為SAL抗AS有效作用靶點提供重要理論依據，并可能為防治AS性心腦血管疾病提供一條有效途徑。

有關丹參多酚酸鹽對TNF-α和IL-6的作用是直接還是間接的，其具體信號轉導途徑如何，還需要大量細致研究證實。但傳統活血化瘀中藥獨特的多效性藥理作用和作用機制多樣性等的特點，可能成為中藥開辟抗AS的新途徑和新方法。

［1］Ross R.Atherosclerosis-an inflammatory disease［J］.N Engl J Med，1999，340（2）：115-126.

［2］杜冠華，張均田.丹參水溶性有效成分：丹酚酸研究進展［J］.基礎醫(yī)學與臨床，2000，20（5）：394-398.

［3］竇維華，陳尚杰，董少龍，等.活血化瘀中藥抗動脈粥樣硬化的研究進展［J］.江蘇中醫(yī)藥，2004，25（1）：59-60.

［4］張 偉，李 鋒，王玉琴，等.二苯乙烯苷對實驗性動脈粥樣硬化大鼠血脂和炎癥因子的調節(jié)作用［J］.中國臨床藥理學和治療學，2007，12（5）：516-520.

［5］Kim JY，Kim HS，Kang HS，et al.Antioxidant potential of dimethyl lithospermate isolated from Salvia miltiorrhiza（red sage）against peroxynitrite［J］.J Med Food，2008，11（1）：21-28.

［6］顏 平，羅心平.丹參多酚酸鹽對血小板功能影響的臨床研究［J］.現代中西醫(yī)結合雜志，2005，14（16）：2092-2094.

［7］Zhao L，Gaudry L，Dunkley S，et al.Modulation of platelet and leucocyte function by a Chinese herbal formulation as compared with conventional antiplatelet agents［J］.Platelets，2008，19（1）：24-31.

［8］顏 平，施海明.丹參多酚酸治療心絞痛患者的臨床療效及對血小板功能的影響［J］.介入放射學雜志，2004，12（2）：552-591.

［9］何雪松，陳建昌，朱凌波.丹參多酚酸鹽對穩(wěn)定型心絞痛患者血液流變學影響的臨床研究［J］.中國血液流變學雜志，2008，18（1）：92-93.

［10］劉志寧，趙慶霞，尤 莉.丹參多酚酸鹽注射液對猝死型冠心病復蘇過程中的心肌保護作用［J］.南方醫(yī)科大學學報，2010，30（3）：645-646.

［2016－06－18收稿，2016－07－15修回］ ［本文編輯：韓仲琪］

The effect of salvianolate on the serum levels of tumor necrosis factor-α and interleukin-6 in knockout ApoE-/-gene mice

GAO Yu－qi①，HU Yu－h(huán)ong，LIANG Chun，et al.①Department of Cardiology，the General Hospital of Jinan Military Region，Jinan，Shandong 250031，China

ObjectiveTo explore the possible antiatherosclerotic mechanism ofsalvianolate，through investigating its effect on the serum levels of tumor necrosis factor－α（TNF－α）and interleukin－6（IL－6）in C57BL/ 6J knockout ApoE－/－gene mice.MethodsForty C57BL/6J ApoE－/－male mice of 4 week－old，and C57BL/6J wild mice （as control group，n=10） were fed by high cholesterol diet，at the same time salvianolate was given intraperitoneally，except for control group being normal with injecting drug.They were injected 5 times per week，1 time/d，randomly divided into 4 groups（10，each group）：model group，low dosage of salvianolate（60 mg/kg）group，medium dosage of salvianolate（120 mg/kg）group，high dosage of salvianolate（240 mg/kg）group.At the end of 24 weeks，serum levels of TNF－α and IL－6 were measured by specific radioimmunoassay.ResultsAt the end of 24 weeks the levels of TNF－α and IL－6 in all the model groups were all significantly increased.The serum levels of TNF－α and IL－6 were decreased in ApoE－/－mice with the increase of salvianolate concentration in low，medium and high groups（P＜0.05）.The serum levels of TNF－α and IL－6 in every salvianolate groups were lower than those in model group（P＜0.05）and still higher than control group（P＜0.05）.ConclusionSalvianolate can decrease the serum levels of TNF－α and IL－6 in C57BL/6 ApoE－/－mice and inhibit inflammation process，which could be possible mechanism of antiatherosclerotic of salvianolate.

Salvianolate；Tumor necrosis factor－α；Interleukin－6；ApoE－/－mice；Radioimmunoassay

R541.4：R－332

A

10.14172/j.issn1671－4008.2016.12.020

250031山東濟南，濟南軍區(qū)總醫(yī)院心內科（高玉琪，胡毓洪）；200003上海，第二軍醫(yī)大學長征醫(yī)院心內科（梁春，吳宗貴）

胡毓洪，Email：dr_huyuhong＠163.com