李博 馬俊 賀歡 王麗萍 許鳴

·基礎(chǔ)研究論著·

肝星狀細(xì)胞對肝癌細(xì)胞株MHCC-LM3上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

李博 馬俊 賀歡 王麗萍 許鳴

目的 探討肝星狀細(xì)胞LX-2對肝癌細(xì)胞株MHCC-LM3上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響。方法 制備肝星狀細(xì)胞LX-2上清，用LX-2上清和MHCC-LM3共培養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)組)，以單獨(dú)培養(yǎng)的MHCC-LM3為對照(對照組)，比較2組的肝癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)、侵襲能力、EMT相關(guān)的上皮標(biāo)記物E-鈣黏蛋白(E-cadherin)及間質(zhì)標(biāo)記物波形蛋白Vimentin蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果 與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組的肝癌細(xì)胞MHCC-LM3形態(tài)拉長，細(xì)胞間連接變得疏松。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，實(shí)驗(yàn)組在共培養(yǎng)12、24、48 h的侵襲細(xì)胞數(shù)均比對照組增多(P均<0.01)；隨著培養(yǎng)時間的延長，實(shí)驗(yàn)組的侵襲細(xì)胞也隨之增多(P均<0.01)。實(shí)驗(yàn)組MHCC-LM3細(xì)胞在共培養(yǎng)24、48 h時的E-cadherin蛋白表達(dá)水平均低于對照組細(xì)胞(P均<0.01)，在共培養(yǎng)12、24、48 h時的Vimentin蛋白表達(dá)水平均高于對照組(P均<0.01)。結(jié)論 肝星狀細(xì)胞能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞株MHCC-LM3的EMT過程，增強(qiáng)其侵襲能力。

肝癌；肝星狀細(xì)胞；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

我國肝癌的病死率在所有惡性腫瘤中僅次于胃癌、肺癌，位列第三。肝癌的遠(yuǎn)期療效不佳，轉(zhuǎn)移率非常高，因而研究肝癌的發(fā)病、轉(zhuǎn)移機(jī)制對改善其預(yù)后有著重要意義。肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移不僅與其所在組織的結(jié)構(gòu)、代謝和功能有關(guān)，還與肝癌細(xì)胞所處的微環(huán)境，即癌細(xì)胞、細(xì)胞因子、多種基質(zhì)細(xì)胞、趨化因子等組成的微環(huán)境有關(guān)[1]。肝星狀細(xì)胞是肝癌微環(huán)境的重要間質(zhì)細(xì)胞，活化的肝星狀細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞因子影響肝癌細(xì)胞微環(huán)境，促進(jìn)肝癌的發(fā)生和發(fā)展[2]。本研究通過建立體外永生化人肝星狀細(xì)胞株LX-2上清與人肝癌細(xì)胞株MHCC-LM3的共培養(yǎng)模型, 觀察共培養(yǎng)后MHCC-LM3細(xì)胞的形態(tài)轉(zhuǎn)變以及MHCC-LM3侵襲能力及其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)變化，初步探討肝星狀細(xì)胞對肝癌細(xì)胞株MHCC-LM3 EMT的影響。

材料與方法

一、材 料

人肝星狀細(xì)胞LX-2、人肝癌細(xì)胞株MHCC-LM3購自上海中科院細(xì)胞研究所。高糖 DMEM 培養(yǎng)基、胰酶消化液購自美國Gibco 公司，Transwell小室購自美國Coming 公司，胎牛血清購自杭州四季清生物公司；Matrigel 生物膠購自美國BD 公司；鼠抗人E-鈣黏蛋白(E-Cadherin)單克隆抗體、鼠抗人波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體及內(nèi)參磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)購自南京凱基公司。

二、方 法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)及肝星狀細(xì)胞上清制備

肝癌細(xì)胞株MHCC-LM3在37 ℃、5%CO2條件下，用10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng), 細(xì)胞長滿單層后用胰蛋白酶消化傳代。肝星狀細(xì)胞LX-2以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至80%滿度，換無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，以10 000×g 離心10 min，收集上清，-80 ℃凍存待用。

2. 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

收集對數(shù)期細(xì)胞，將MHCC-LM3細(xì)胞調(diào)至1×108/L，以DMEM培養(yǎng)基接種于96孔板中，每孔200 μl, 培養(yǎng)至約80%滿度, 換成無血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)18 h, 實(shí)驗(yàn)組加入上述制備的200 ml LX-2上清，分別繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h，對照組用無血清培養(yǎng)基分別繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h，到時間點(diǎn)后于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

3. Transwell侵襲試驗(yàn)

將基底膜鋪在Transwell膜上, 37 ℃包被聚合，加入含牛血清白蛋白的無血清培養(yǎng)基，置37 ℃ 30 min。在Transwell上室加入MHCC-LM3，實(shí)驗(yàn)組下室加入2 ml LX-2上清，對照組為下室加入的無血清培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)12、24、48 h，到時間點(diǎn)后，取出小室，用棉簽擦掉小室上室面的細(xì)胞及基質(zhì)膠，于95%乙醇中固定15 min，3%結(jié)晶紫染色30 min。將小室放于倒置顯微鏡下，200 倍放大倍數(shù)下隨機(jī)觀察細(xì)胞侵襲情況，每個樣本隨機(jī)取10 個視野(放大倍數(shù) 200倍)拍照，計數(shù)侵襲至小室下層的細(xì)胞，取平均值。每組重復(fù)3次。

4. 蛋白免疫印跡法

收集各組細(xì)胞，加入600 μl RIPA細(xì)胞裂解液，置冰上30 min后，離心30 min，上清即為總的細(xì)胞蛋白溶解成分。上清加等量2倍十二烷基磺酸鈉(SDS)上樣緩沖液在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，然后電轉(zhuǎn)膜到醋酸纖維膜上，用50 g/L脫脂奶粉封閉，分別加入相應(yīng)一抗(E-Cadherin、Vimentin抗體)，4℃孵育過夜，Tris-HCl緩沖液洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶10 000)在37℃孵育2 h，常規(guī)洗膜3次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)熒光顯色系統(tǒng)檢測，X線片感光顯影，AlphaImager 2200圖像系統(tǒng)分析灰度值。每組重復(fù)3次。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1. 肝星狀細(xì)胞上清對肝癌細(xì)胞MHCC-LM3形態(tài)的影響

MHCC-LM3呈卵圓形、長橢圓形的上皮樣細(xì)胞形態(tài)，其形態(tài)規(guī)則，相互間排列緊密，經(jīng)與肝星狀細(xì)胞LX-2上清共培養(yǎng)12、24、48 h后，其細(xì)胞形態(tài)與對照組相比，逐漸由圓形片團(tuán)狀生長變化為長梭形，細(xì)胞的移動不像對照組細(xì)胞整片或整塊地移動，能單個活動，離開原來的位置，明顯出現(xiàn)EMT的特征性形態(tài)學(xué)改變，見圖1。

2. 肝星狀細(xì)胞上清對肝癌細(xì)胞MHCC-LM3侵襲性的影響

肝星狀細(xì)胞上清培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株MHCC-LM3在12、24、48 h的侵襲細(xì)胞數(shù)均多于對照組(12 h：68.67±3.61vs. 38.68±5.56，t=13.008、P<0.001；24 h：125.34±5.23vs. 57.06±5.25，t=9.077、P<0.001；48 h：276.38±5.53vs. 108.69±3.55，t=11.067、P<0.001)。實(shí)驗(yàn)組中，肝星狀細(xì)胞上清培養(yǎng)24 h時的侵襲細(xì)胞數(shù)多于12 h時(t=8.162、P<0.001)，48 h時的侵襲細(xì)胞數(shù)亦多于24 h時(t=10.187、P<0.001)，見圖2。

圖1 肝星狀細(xì)胞上清對肝癌細(xì)胞株MHCC-LM3形態(tài)的影響(×400)

A：對照組；B：實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)12 h；B：實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)24 h；B：實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)48 h

3. 肝星狀細(xì)胞上清對肝癌細(xì)胞MHCC-LM3中EMT相關(guān)上皮標(biāo)記物的影響

肝癌細(xì)胞株MHCC-LM3經(jīng)與肝星狀細(xì)胞LX-2上清培養(yǎng)24、48 h后其上皮標(biāo)記基因E-cadherin蛋白表達(dá)水平均低于對照組，分別為2.020±0.178vs. 1.652±0.021(t=6.067，P<0.001)、1.478±0.262vs. 1.073±0.062 (t=5.377，P<0.001)，而12 h時2組E-cadherin蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。肝癌細(xì)胞株MHCC-LM3經(jīng)與肝星狀細(xì)胞LX-2上清培養(yǎng)12、24、48 h后其上皮標(biāo)記基因Vimentin蛋白表達(dá)均高于對照組，分別為1.172±0.182vs. 1.397±0.152 (t=5.071，P<0.001)、1.302±0.062vs. 1.772±0.092 (t=6.827，P<0.001)、1.688±0.123vs. 2.166±0.072(t=5.067、P<0.001)，見圖 3。

討 論

腫瘤微環(huán)境是惡性腫瘤生物學(xué)特性的研究熱點(diǎn)，腫瘤細(xì)胞能表達(dá)多種細(xì)胞趨化因子受體，并在微環(huán)境中其他的基質(zhì)細(xì)胞合成趨化因子的作用下，促使腫瘤生長并向他處轉(zhuǎn)移。在肝癌組織中，肝星狀細(xì)胞是重要的間質(zhì)細(xì)胞。 近年發(fā)現(xiàn)EMT在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的過程中起著重要作用[3]。EMT參與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移，以上皮表型的缺失和間質(zhì)表型的獲得為主要特征[4]。

活化的肝星狀細(xì)胞發(fā)生了形態(tài)學(xué)和功能學(xué)的雙重變化，表現(xiàn)為：①細(xì)胞體積變大，增殖活躍；②脂質(zhì)減少或丟失；③α-平滑肌蛋白表達(dá)陽性；④不僅對細(xì)胞因子如血小板源生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β反應(yīng)性增加，并自分泌大量細(xì)胞因子維持其自身活化狀態(tài)；⑤同時分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，尤其是Ⅰ、Ⅲ型膠原[5-7]。肝癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移伴隨著肝星狀細(xì)胞的活化，肝星狀細(xì)胞的活化能否對肝癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化起促進(jìn)作用，目前相關(guān)報道較少。本研究中，將人肝星狀細(xì)胞LX-2上清與人肝癌細(xì)胞MHCC-LM3共培養(yǎng)后，肝癌細(xì)胞由原來的圓形片團(tuán)狀生長變化為長梭形，并且表現(xiàn)出細(xì)胞間連接減弱、分離、組織間極性下降的傾向，表現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)特征。隨后的Transwell侵襲試驗(yàn)結(jié)果顯示，肝星狀細(xì)胞的上清能夠使得MHCC-LM3細(xì)胞更加具有侵襲性，并隨著共培養(yǎng)時間的延長, MHCC-LM3細(xì)胞的侵襲能力也隨之增強(qiáng)，符合MHCC-LM3經(jīng)誘導(dǎo)EMT后侵襲性增強(qiáng)的特點(diǎn)，提示肝星狀細(xì)胞可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞株MHCC-LM3的EMT，這可能與活化后的肝星狀細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞因子影響肝癌細(xì)胞微環(huán)境有關(guān)。

圖2 肝星狀細(xì)胞上清對肝癌細(xì)胞株MHCC-LM3侵襲性的影響(×200)

A：對照組12 h；B：對照組24 h；C：對照組48 h；D：實(shí)驗(yàn)組12 h；E：實(shí)驗(yàn)組24 h；F：實(shí)驗(yàn)組48 h；G：定量分析結(jié)果；與對照組比較，*P<0.01；與實(shí)驗(yàn)組前一時間點(diǎn)比較，#P<0.01

判斷EMT的發(fā)生，除細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生變化之外，更為重要的指標(biāo)是其相關(guān)標(biāo)記蛋白表達(dá)的變化。上皮標(biāo)記物E-cadherin是一種跨膜蛋白，在維持上皮結(jié)構(gòu)整體性方面起重要作用，其丟失會使相鄰細(xì)胞分離，并導(dǎo)致上皮細(xì)胞極性消失，使得相鄰細(xì)胞之間連接變得疏松，E-cadherin表達(dá)降低或缺失是EMT重要的變化[8]。Vimentin是間質(zhì)細(xì)胞來源的骨架蛋白，在上皮細(xì)胞不表達(dá)或表達(dá)非常低下。這類蛋白增多會導(dǎo)致骨架蛋白構(gòu)成變化，使上皮源性細(xì)胞具有成纖維細(xì)胞特征，易于遷移及黏附[9]。因此E-cadherin表達(dá)降低，Vimentin間質(zhì)蛋白表達(dá)增高被認(rèn)為是EMT發(fā)生的標(biāo)志。本研究采用蛋白免疫印跡法檢測EMT相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，肝星狀細(xì)胞上清與肝癌細(xì)胞株MHCC-LM3共培養(yǎng)后，其E-cadherin蛋白表達(dá)水平下降、Vimentin蛋白表達(dá)水平升高，進(jìn)一步證實(shí)肝星狀細(xì)胞對肝癌細(xì)胞株MHCC-LM3的EMT起促進(jìn)作用。

圖3 肝星狀細(xì)胞上清對肝癌細(xì)胞株MHCC-LM3 EMT相關(guān)上皮標(biāo)記物的影響

A：蛋白免疫印跡結(jié)果；B、C：定量分析結(jié)果；與對照組比較，*P<0.01；與實(shí)驗(yàn)組前一時間點(diǎn)比較，#P<0.01

綜上所述，肝星狀細(xì)胞促進(jìn)肝癌細(xì)胞的EMT，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲能力，而其作用機(jī)制將是我們下一步研究的重點(diǎn)方向。

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(本文編輯：林燕薇)

Effect of hepatic stellate cell on epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma MHCC-LM3 cell line

LiBo,MaJun,HeHuan,WangLiping,XuMing.

DepartmentofGastroenterology,GuangdongNO.2ProvincialPeopleHospital,Guangzhou510317,China

,XuMing,E-mail: 177xm@163.com

Objective To investigate the effect of hepatic stellate cells on the epithelial-mesenchymal transition (EMT) of hepatocellular carcinoma MHCC-LM3 cell line. Methods MHCC-LM3 cells were co-incubated with the culture supernatant of LX-2 in the study group, and the untreated MHCC-LM3 cells were as the control. The morphological changes, invasion ability, and the changes in the expression of E-cadherin and Vimentin proteins were statistically compared between two groups. Results Compared with the control group, the MHCC-LM3 cells co-incubated with the supernatant of LX-2 were elongated and the cell-cell junction became looser. Transwell assay revealed that the quantity of invasive MHCC-LM3 cells co-incubated for 12-, 24- and 48-h in the study group was significantly higher compared with that in the control group (allP<0.01). Meantime, the quantity of invasive MHCC-LM3 cells in the study group was significantly enhanced over the time of incubation (allP<0.01). In the study group, the expression levels of E-cadherin protein after 24- and 48-h incubation were considerably lower than those in the control group (bothP<0.01). The expression levels of Vimentin protein after 12-, 24- and 48- incubation in the study group were significantly up-regulated compared with those in the control group (allP<0.01). Conclusion Hepatic stellate cells can promote the EMT and enhance the invasion of hepatocellular carcinoma MHCC-LM3 cell line.

Hepatocellular carcinoma; Hepatic stellate cell; Epithelial-mesenchymal transition

10.3969/j.issn.0253-9802.2016.12.004

510317 廣州，廣東省第二人民醫(yī)院消化科(李博，許鳴)；528031 佛山，佛山市第二人民醫(yī)院消化科(馬俊，王麗萍)；510030 廣州，廣東省婦幼保健院(賀歡)

，許鳴，E-mail：177xm@163.com

2016-07-13)