吳衛(wèi)玲，胡同靜，鐘君杰，徐振東

(1.江蘇省蘇州出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 蘇州 215104；2.江蘇省蘇州世標(biāo)檢測(cè)技術(shù)有限公司，江蘇 蘇州 215104)

食品中蠟樣芽孢桿菌平板計(jì)數(shù)的不確定度評(píng)定

吳衛(wèi)玲1,2，胡同靜1,2，鐘君杰1,2，徐振東1

(1.江蘇省蘇州出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 蘇州 215104；2.江蘇省蘇州世標(biāo)檢測(cè)技術(shù)有限公司，江蘇 蘇州 215104)

目的：為確保食品中蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)結(jié)果的精確度。方法：依據(jù)GB 4789.14-2014中平板計(jì)數(shù)法對(duì)食品中蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行不確定度的評(píng)定。結(jié)果：蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)結(jié)果的擴(kuò)展不確定度為0.28，當(dāng)樣品中蠟樣芽孢桿菌平板計(jì)數(shù)法的檢測(cè)結(jié)果以平行樣對(duì)數(shù)值的平均值表示時(shí)，其取值區(qū)間為3.17±0.28。 結(jié)論：建立的方法評(píng)定的不確定度可適用于食品的合格性判斷。

食品；蠟樣芽孢桿菌；平板計(jì)數(shù)法；不確定度

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)廣泛分布于自然界，近年來在各類食品中的檢出率較高。蠟樣芽孢桿菌可產(chǎn)生不同毒素，引發(fā)食物中毒：一種是致吐型，是由于食品在食用前保存溫度不當(dāng)，放置時(shí)間過長(zhǎng)使污染在食品中的蠟樣芽孢桿菌或殘存的芽孢得以生長(zhǎng)繁殖，并產(chǎn)生毒素而引發(fā)嘔吐；另一種是致腹瀉型，是由于食入較多蠟樣芽孢桿菌而產(chǎn)生的熱穩(wěn)定毒素，導(dǎo)致食物中毒[1]。根據(jù)香港《食品微生物含量指引》：一般即食食品含超過105cfu/g蠟樣芽孢桿菌，可能危害食用者的健康或不宜供人食用[2]。目前已從多種食品中分離出該菌，包括肉、乳制品、蔬菜、魚、土豆、糊、醬油、布丁、炒米飯以及各種甜點(diǎn)等。在美國(guó)，炒米飯是引發(fā)蠟樣芽孢桿菌嘔吐型食物中毒的主要原因；在歐洲，大多由甜點(diǎn)、肉餅、色拉和奶、肉類食品引起；在我國(guó)，則主要與受污染的米飯或淀粉類制品有關(guān)。食品中蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)采用平板計(jì)數(shù)法時(shí)，實(shí)驗(yàn)過程包含諸多不確定因素。本實(shí)驗(yàn)對(duì)在同一相對(duì)恒定實(shí)驗(yàn)條件下，在同一時(shí)間段內(nèi)，同一位檢測(cè)人員應(yīng)用同一批次的培養(yǎng)基和試劑，對(duì)同一批樣品進(jìn)行10次蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)定。

1 原理與方法

1.1 原理

依據(jù)GB 4789.14-2014食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)》[3]第一法蠟樣芽孢桿菌平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢驗(yàn)，程序見圖1。在同一相對(duì)恒定實(shí)驗(yàn)條件下，同一位實(shí)驗(yàn)人員對(duì)同一批次食品樣品進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)定。本次樣品為均勻并含可計(jì)算得出數(shù)目蠟樣芽孢桿菌的固體食品。

圖1 蠟樣芽孢桿菌平板計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序Fig.1 The testing program of Bacillus cereusby plate count method

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 樣品制備

取1 kg不含蠟樣芽孢桿菌的米飯于無菌取樣袋中，加入100 mL無菌生理鹽水，同時(shí)加入制備好的蠟樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC11778)，用拍擊式均質(zhì)器拍擊2 min，制成待測(cè)樣品。

1.2.2 樣品檢測(cè)

稱取25 g米飯置于盛有225 mL生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打2 min，制成1∶10的樣品稀釋液。用1 mL滅菌微量移液器取1∶10樣品稀釋液1 mL，沿管壁緩緩注入含有9 mL滅菌生理鹽水的試管內(nèi)。振搖試管使其混勻，制成1∶100的樣品稀釋液，根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，按上述操作，依次制成10倍遞增系列稀釋樣品稀釋液。每遞增稀釋1次，換用1支1 mL無菌吸頭。選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，每個(gè)稀釋度以0.3，0.3，0.4 mL接種量，分別接種在3塊選擇性培養(yǎng)基——甘露醇卵黃多粘菌素(MYP)瓊脂平板上，用 L形棒涂布于整個(gè)表面，注意不要觸及平板邊緣。在通常情況下，涂布后，將平板靜置10 min。如樣液不易吸收，可將平板放在培養(yǎng)箱(30±1) ℃培養(yǎng)1 h，等樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平皿，倒置于培養(yǎng)箱中，(30±1) ℃培養(yǎng)(24±2) h。如果菌落不典型，可繼續(xù)培養(yǎng)(24±2) h再觀察。在MYP瓊脂平板上，典型菌落為微粉紅色(表示不發(fā)酵甘露醇)，周圍有白色至淡粉紅色沉淀環(huán)(表示產(chǎn)卵磷脂酶)。選取適當(dāng)菌落數(shù)平板計(jì)數(shù)，從每個(gè)平板中挑取5個(gè)典型菌落，分別劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板做純培養(yǎng)，(30±1) ℃培養(yǎng)(24±2) h，進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)。

1.3 數(shù)學(xué)模型的建立

選擇1∶10和1∶100兩個(gè)稀釋度中只有一個(gè)稀釋度的平板菌落數(shù)在20～200 cfu之間且有典型菌落，計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落的條件下，建立數(shù)學(xué)模型：T = Cd/AB 。

式中： T為樣品中蠟樣芽孢桿菌菌落數(shù)； A為某一稀釋度蠟樣芽孢桿菌典型菌落的總數(shù)(本實(shí)驗(yàn)為1∶10稀釋度)； B為鑒定結(jié)果為蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)；C為用于蠟樣芽孢桿菌鑒定的菌落數(shù)；d 為稀釋因子(本實(shí)驗(yàn)d=10)。由于本實(shí)驗(yàn)采用添加陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株，故B/C為1。

2 結(jié)果

2.1 不確定度來源

微生物檢驗(yàn)中，一般僅對(duì)由樣液制備、樣液稀釋、加樣體積引起的不確定度進(jìn)行分析，對(duì)來源于培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、操作人員操作技能等不便計(jì)算的不確定度忽略不計(jì)。

2.2 樣液制備產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度(Um)

2.2.1 天平引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度(Um1)

2.2.2 量筒引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度(Um2)

2.2.3 樣液制備產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度(Um)

Um1和Um2是兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分量，則Um2=Um12+Um22=0.0122+0.0042=0.01262。

2.3 樣液稀釋產(chǎn)生的不確定度(Uv)

2.3.1 移液器和分度吸量管(移液管)產(chǎn)生的不確定度分量 (Uv1，Uv2)

2.3.2 稀釋產(chǎn)生的不確定度(Uv)

在蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)過程中，采用100倍稀釋，故稀釋不確定度包括開始的10倍稀釋和后續(xù)的10倍系列稀釋。每步稀釋所產(chǎn)生的不確定度Uvx2=(Ux12+Ux22)×bx2/(ax+bx)2。本次由連續(xù)稀釋所產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確度Uv2=(Um12+Um22)×2252/(25+225)2+K×(Uv12+Uv22)×92/(1+9)2=(0.0122+0.0042)×0.81+K×(0.0042+0.0022)×0.81=0.01212，Uv=0.0121。K 為≥0的整數(shù)，當(dāng)樣品僅稀釋10倍時(shí)，K=0；當(dāng)樣品稀釋 100倍時(shí)，K=1；當(dāng)樣品稀釋1000倍時(shí)，K=2，依次類推。稀釋倍數(shù)越多，K值越大，稀釋所產(chǎn)生的不確定度越大。

本次實(shí)驗(yàn)在20 ℃溫度條件下進(jìn)行，因此可忽略移液器、移液管等溫度與校準(zhǔn)時(shí)溫度不同而引起的不確定度。若溶液溫度不為20 ℃時(shí)，必須考慮溫度對(duì)體積的影響。

2.4 加樣體積產(chǎn)生的不確定度(Uj)

2.5 合成不確定度(Uy)

則u(T)=T×Uy =1.43×103×0.0384=2.69。

2.6 檢測(cè)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)10次檢測(cè)結(jié)果T分別為1.80×103，1.60×103，1.40×103，1.30×103，1.20×103，1.40×103，1.20×103，1.80×103，1.70×103，1.50×103cfu/g，平均值T為1.49×103cfu/g，則 log T=3.17。

2.7 擴(kuò)展不確定度

取置信概率p=95%，自由度γ=10-1=9，由t分布表可得k=2.26。故Urel=k×Uy=2.26×0.0384=0.086784≈0.087，則U=Urel×log T≈0.087×3.17≈0.28。

2.8 不確定度報(bào)告

當(dāng)樣品中蠟樣芽孢桿菌平板計(jì)數(shù)法的檢測(cè)結(jié)果以平行樣對(duì)數(shù)值的平均值表示時(shí)，其取值區(qū)間為3.17±0.28；當(dāng)檢測(cè)結(jié)果以平行樣的平均值表示時(shí)，相對(duì)于對(duì)數(shù)值的取值再取反對(duì)數(shù)得其取值區(qū)間分布。

3 討論

食品中蠟樣芽孢桿菌的平板計(jì)數(shù)法實(shí)驗(yàn)步驟復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)過程中的不確定因素較多，不確定度的來源包括樣液制備、樣液稀釋、加樣體積等，其中對(duì)來源于培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、操作人員操作技能等不便計(jì)算的不確定度可忽略不計(jì)。除了來源于以上介紹的幾種不確定度外，還有來源于樣品的種類、性狀和穩(wěn)定性、檢測(cè)操作的環(huán)境、微生物培養(yǎng)條件、菌落計(jì)數(shù)、培養(yǎng)基、菌落的相互重疊等產(chǎn)生的不確定度，但均可以通過嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)環(huán)境、培養(yǎng)條件、提高檢測(cè)人員的操作技能，來降低其不確定度來源。

在 CNAS-CL07：2011《測(cè)量不確定度評(píng)估和報(bào)告通用要求》[7]中8.2規(guī)定：檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有能力對(duì)每一項(xiàng)有數(shù)值要求的測(cè)量結(jié)果進(jìn)行測(cè)量不確定度評(píng)估。測(cè)量結(jié)果不確定度的評(píng)定是檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量體系的重要組成部分，而且測(cè)量結(jié)果不確定度的評(píng)定可以使實(shí)驗(yàn)室提供的數(shù)據(jù)更具有效性、科學(xué)性、公正性、可靠性。本文采用的評(píng)定方法適用于日常工作中，食品中蠟樣芽孢桿菌平板法計(jì)數(shù)結(jié)果的不確定度評(píng)定，其不確定度主要來源于樣品稀釋、加樣和重復(fù)檢測(cè)等方面。

[1]齊哲,張偉,劉衛(wèi)華,等.FTA濾膜與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)結(jié)合快速檢測(cè)消毒乳中的蠟樣芽孢桿菌[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2009(3):156-161.

[2]香港食品環(huán)境衛(wèi)生署食品安全中心.食品微生物含量指引[Z].2014:13.

[3]GB 4789.14-2014,食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)[S].

[4]JJC 1036-2008,電子天平[S].

[5]JJG 196-2006,常用玻璃量器[S].

[6]JJG 646-2006,移液器檢定規(guī)程[S].

[7]CNAS-GL07：2011,測(cè)量不確定度評(píng)估和報(bào)告通用要求[S].

The Uncertainty Evaluation of Plate Count Method for Bacillus cereus in Food

WU Wei-ling1,2, HU Tong-jing1,2, ZHONG Jun-jie1,2, XU Zhen-dong1

(1.Suzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Suzhou 215104, China;2.Suzhou World Standard Testing Technology Co., Ltd., Suzhou 215104, China)

Objective:To ensure the accuracy of testing results ofBacilluscereusin food. Methods: According to GB 4789.14-2014, the uncertainty of plate count method for detection ofBacilluscereusin food is evaluated. Results: The expanded uncertainty of detection results is 0.28, when the testing result ofBacilluscereusin food by using the plate count method is in parallel to the sample for average value, the value range is 3.17±0.28. Conclusion: The uncertainty evaluation can accurately evaluate the eligibility of food and ensure the safety of food.

food;Bacilluscereus; plate count method; uncertainty

2016-06-22

吳衛(wèi)玲(1987-)，女，工程師，碩士，研究方向：食品化妝品微生物學(xué)。

TS201.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2016.12.027

1000-9973(2016)12-0118-04