關(guān) 皎 ， 朱鶴云 ， 馮 春 ， 張 穎 ， 郝乘儀 ， 馮 波

(吉林醫(yī)藥學院藥學院 ， 吉林吉林132013)

超快速液相色譜法同時測定車前子中京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的含量

關(guān) 皎 ， 朱鶴云 ， 馮 春 ， 張 穎 ， 郝乘儀 ， 馮 波

(吉林醫(yī)藥學院藥學院 ， 吉林吉林132013)

建立超快速液相色譜法同時測定車前子中京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的含量， 為車前子藥材的質(zhì)量控制提供參考。 采用Shim-Pack XR-ODS柱(75 mm×3.0 mm, 2.2 μm)；流動相為0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)， 梯度洗脫(0～11 min， 20%～65%B)， 平衡時間為3 min； 流速為0.4 mL/min； 檢測波長為254 nm； 柱溫為35℃。 結(jié)果： 京尼平苷酸和毛蕊花糖苷分別在16-160 μg/mL(R=0.9996)、 8-80 μg/mL(R=0.9995)濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系； 平均回收率(n=9)分別為99.0%和99.4%。 結(jié)論：該方法結(jié)果準確、 操作簡便、 具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性， 可用于車前子藥材的質(zhì)量控制， 同時為新獸藥開發(fā)利用提供參考。

車前子 ； 京尼平苷酸 ； 毛蕊花糖苷 ； 超快速液相色譜法

車前子為車前科植物車前(L.Plantagoasiatica)或平車前(PlantagodepressaWilld).的干燥成熟種子。性寒、味甘、歸腎、膀胱、肝、肺經(jīng)，具有利水通淋、滲濕止瀉、清肝明目、清熱化痰的功效[1]。主要分布于江西、黑龍江、遼寧、河北等省。車前子主要含有環(huán)烯醚萜類、苯乙醇苷類、黃酮類、多糖等化合物[2-3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，車前子具有利尿、降血脂、降血糖、祛痰、鎮(zhèn)咳、抗炎、明目、抗腫瘤等藥理作用[4-5]。目前，文獻報道的車前子質(zhì)量控制方法包括紫外法[6]、薄層色譜法[7-8]和高效液相色譜法[9]。然而，這些方法存在專屬性差、分析時間長、檢測指標少、樣品處理復(fù)雜等缺點。近年來，超快速液相色譜(Ultra-fast liquid chromatography, UFLC)技術(shù)由于在峰容量、分析效率、靈敏度和分辨率方面均優(yōu)于常規(guī) HPLC，并可在極短的時間內(nèi)達到柱平衡或重新平衡，顯著減少分析時間，同時相應(yīng)會減少溶劑消耗，已越來越多的應(yīng)用于中藥成分分析研究[10-11]。本研究首次采用超快速液相色譜法測定車前子中京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的含量，所建立的定量分析方法分析時間短，分析效率明顯提高，可為車前子的質(zhì)量評價提供科學依據(jù)，有利于將車前子的藥用價值充分應(yīng)用于獸藥行業(yè)，為天然藥物應(yīng)用于獸藥領(lǐng)域提供參考。

1 儀器與試藥

Prominence UFLC型超高快速液相色譜儀(配備Prominence SIL-20AHT自動進樣器，LC-20AD二元泵，CTO-20A柱溫箱，SPD-20A紫外檢測器，LC solution色譜工作站，日本島津公司)；KQ-250DE型數(shù)控聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；CPA 225D型電子天平(德國賽多利斯儀器有限公司)。

甲醇為色譜純(美國Fisher科技)，所用水為經(jīng)過Milli-Q型超純水儀凈化后的超純水，其他試劑均為分析純。對照品京尼平苷酸(批號：110753-201415)和毛蕊花糖苷(批號：111530-201512)，購自中國食品藥品檢定研究院，純度均大于98%。

車前子藥材，分別購自吉林市吉林大藥房和吉林市同仁堂大藥房，產(chǎn)地均為江西省，經(jīng)吉林醫(yī)藥學院生藥教研室李景華副教授鑒定為車前科植物，樣本留存于吉林醫(yī)藥學院藥學院中藥樣品室。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的配制 分別精密稱取對照品京尼平苷酸、毛蕊花糖苷對照品適量，置于5 mL容量瓶中，用60%甲醇稀釋并定容至刻度，制成含京尼平苷酸0.8 mg/mL、毛蕊花糖苷0.4 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 取車前子藥材粉末(過40目篩)約0.5 g，精密稱定，置50 mL錐形瓶中，加入60%甲醇50 mL，稱定重量，回流提取2 h，放冷后再稱重，用60%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。取續(xù)濾液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后作為供試品溶液。

2.3 色譜條件 采用Shim-Pack XR-ODS色譜柱(75mm×3.0 mm, i.d. 2.2 μm)，預(yù)柱為C18保護柱(4 mm×3.0 mm, i.d. 2.2 μm)，流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～11 min，20%～65%B，11～14 min，65%～20%B)，平衡時間3 min，流速0.4 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫35 ℃，進樣量5 μL。色譜圖見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，置于5 mL量瓶中，用甲醇-水(60∶40)定容至刻度，依次注入液相色譜儀，測定色譜峰面積，以進樣量X(μg)為橫坐標，色譜峰面積積分值(Y)為縱坐標，進行線性回歸，京尼平苷酸、毛蕊花糖苷的回歸方程分別為：

圖1 混合對照品(A)、樣品(B)色譜圖

1：京尼平苷酸(geniposidic acid)； 2：毛蕊花糖苷(acteoside)

Y= 2.000×106X+ 1.00636×105R= 0.9996;Y= 2.000×106X+ 3.370×104R = 0.9995

結(jié)果表明，京尼平苷酸、毛蕊花糖苷濃度分別在16-160 μg/mL、8-80 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗 分別精密吸取“2.4”項下制備的第3混合對照品溶液5 μL， 按上述色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果京尼平苷酸、毛蕊花糖苷峰面積的RSD(n=6)分別為1.5%和0.8%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批次的供試品溶液，放置于室溫，分別于0，2，4，8，12，24 h進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果京尼平苷酸、毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為2.5%，1.3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗 取同一批車前子樣品6份，精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣5 μL，計算京尼平苷酸、毛蕊花糖苷的含量，結(jié)果上述2種成分的含量的平均值(n=6)分別為1.96%和0.99%；RSD分別為1.5%和0.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗 精密稱取已知含量(京尼平苷酸和毛蕊花糖苷含量分別為1.97%和0.99%)的車前子樣品粉末9份，每份0.25g，精密稱定，分別加入相當于樣品中京尼平苷酸和毛蕊花糖苷含量的80%，100%，120%的對照品溶液適量，各3份。按“2.2”項下的方法制備供試品溶液，進樣5 μL測定，計算京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的回收率和RSD，結(jié)果見表1。

表1 車前子樣品中京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的回收率

2.9 樣品含量測定 精密稱取6批車前子樣品粉末(1-3批購自吉林市吉林大藥房，生車前子，4-6批購自吉林市同仁堂大藥房，鹽車前子)，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣5 μL，每個溶液進樣3次，計算京尼平苷酸、毛蕊花糖苷的含量。6批樣品測定結(jié)果見表2。

表2 車前子樣品中京尼平苷酸、毛蕊花糖苷的含量 (%，n =6)

3 討論

3.1 流動相的優(yōu)化 分別考察了的甲醇-0.5%醋酸、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.5%醋酸、乙腈-0.1% 甲酸共4種流動相體系，結(jié)果表明，甲醇-0.1% 甲酸作為流動相時能夠獲得較好的分離效果，分析時間為10 min，與文獻[12-14]中采用常規(guī)HPLC相比分析時間明顯縮短，且藥材中其他色譜峰不干擾樣品的測定。

3.2 檢測波長的選擇 采用二極管陣列檢測器(DAD)進行全波長掃描，結(jié)果顯示，京尼平苷酸在235 nm，485 nm，693 nm處有最大吸收波長，毛蕊花糖苷在274 nm，334 nm處有最大吸收。綜合考慮雜峰影響，基線平穩(wěn)，色譜峰峰形，最大吸收等因素，本試驗選擇254 nm作為檢測波長。

3.3 提取方法及提取溶劑的選擇 本試驗對比了回流法和超聲法提取車前子中京尼平苷酸、毛蕊花糖苷的提取效果。結(jié)果表明，回流提取2 h所得供試品中上述兩種活性成分的含量明顯高于超聲提取法。本試驗對比了60%、80%、100%乙醇溶液和60%、80%、100%甲醇溶液對車前子中2種活性成分的提取效率，結(jié)果顯示，60%甲醇的綜合提取效率最高，故本試驗采用60%甲醇作為提取溶劑。

3.4 本研究建立UFLC法同時測定車前子中京尼平苷酸、毛蕊花糖苷的含量，并應(yīng)用該方法測定了6批河北產(chǎn)車前子中2種活性成分的含量。購自吉林大藥房的3批車前子和購自吉林市同仁堂大藥房的3批車前子均符合藥典要求(藥典規(guī)定車前子中京尼平苷酸含量不低于0.50%，毛蕊花糖苷含量不低于0.40%；鹽車前子中京尼平苷酸含量不低于 0.40%，毛蕊花糖苷含量不低于0.30%)。但炮制后車前子中2種活性成分含量明顯升高，與文獻報道結(jié)果一致[15]，由此可見車前子經(jīng)鹽制入藥有一定的科學性。本研究建立的分析方法簡單、快速、可靠，可用于車前子藥材的質(zhì)量控制。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典: 2015 年版一部[S]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社，2015: 301-302.

[2] 鄭秀棉，楊莉，王崢濤. 車前子的化學成分與藥理活性研究進展[J]. 中藥材，2013, 36(7): 1190-1196.

[3] 張曉方. 車前子化學成分與藥理活性研究[J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2014, 10(12): 33-34.

[4] 謝明，楊爽爽，王亮亮，等. 中藥車前子的研究進展[J]. 黑龍江醫(yī)藥，2015, 28(3): 474-476.

[5] 王劭華，羅光明，曾金祥，等. 中藥車前子的化學成分及藥理學研究進展[J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2008, 4(9): 133-135.

[6] 林慧霞，聶少平，謝明勇，等. 大粒車前子多糖的分離純化及理化性質(zhì)測定[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)工程，2015, 39(02): 5-10.

[7] 康帥，周超，魏愛華，等. 車前子與其偽品-柴胡果實的生藥學鑒別[J]. 中國實驗方劑學雜志，2013,19(2): 5-10.

[8] 俞作仁，陳立德，周印鎖. 車前子及其混偽品的鑒別研究[J]. 中醫(yī)藥學報，2000, 19(18): 36-37.

[9] 鐘瑞建，俞燕，丁劍虹，等. 車前子中車前素的TLC鑒別及HPLC含量測定[J]. 藥物分析雜志，2015, 35(4): 715-718.

[10] 李國俊. 高效液相色譜法快速檢測中藥復(fù)方炮制液中芍藥苷含量[J]. 河北省科學院報，2013, 30(3):59-62.

[11] 李啟艷，王榮梅. 快速溶劑萃取-超高效液相色譜法測定穩(wěn)心顆粒中皂苷類成分[J]. 藥物分析雜志，2015, 35(3): 528-531.

[12] 萬茵，謝明勇，何彥林. 反相高效液相色譜法同時測定車前子中的毛蕊花苷和異毛蕊花苷[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2008, 20(3): 474-476.

[13] 邱倬星，熊學敏，胡曉艷，等. 車前子超微速溶飲片中京尼平苷酸與毛蕊花糖苷的測定[J]. 中國醫(yī)藥科學，2013,3(05): 41-43.

[14] 王隸書，王友聯(lián)，李明洋，等. HPLC測定市售車前子中毛蕊花糖苷的含量[J].中國藥師，2011,14(11): 1581-1582.

[15] 王俞燕，鐘瑞建，丁劍虹，等. HPLC法同時測定不同產(chǎn)地車前子生品及鹽炙品中3個主要活性成分的含量[J]. 藥物分析雜志，2015, 35(5): 889-892.

Simultaneous determination of geniposidic acid and acteoside inPlantaginisSemenby UFLC

GUAN Jiao , ZHU He-yun , FENG Chun , ZHANG Ying , HAO Cheng-yi , FENG Bo

(College of Pharmacy , Jilin Medical University , Jilin 132013 , China)

To establish an ultra-fast liquid chromatography (UFLC) method for the determination of geniposidic acid and acteoside inPlantaginisSemen. Chromatographic separation was performed on Shim-Pack XR-ODS column(75 mm×3.0 mm, 2.2 μm); The mobile phase was 0.1% formic acid (A)-acetonitrile (B) with gradient elution(0～11 min， 20%～65%B)at a flow rate of 0.4 mL·min-1and the equilibration time was 3 min; The detecting wavelength was set at 254 nm and column temperature was maintained at 35 °C. The linear ranges were 16-160 μg·mL-1(r=0.9996) for geniposidic acid and 8.0-80 μg·mL-1(r=0.9995) for acteoside; The average recovery (n=9) of geniposidic acid and acteoside were 99.0% and 99.4%. The developed method is simple, and accurate with high repeatability and stability, which is suitable for the quality control ofPlantaginisSemenand can provide references for the development and utilization of new veterinary drugs.

PlantaginisSemen; Geniposidic acid; Acteoside; UFLC

FENG Bo

2016-07-07

吉林省衛(wèi)生廳科研課題(2013Z008)；吉林省科技廳科研課題(200905113)

關(guān)皎(1983-)，女，講師，博士，研究方向為中藥質(zhì)量控制及藥代動力學，E-mail: rainbowguanjiao@sina.com

馮波, E-mail：fengbo2@sina.com

R 917

A

0529-6005(2016)00-0104-03