邱 妍 ， 董發(fā)明 , 楊國(guó)棟 ， 林 霖

(河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 河南洛陽(yáng)471003)

自擬中藥復(fù)方對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能的影響

邱 妍 ， 董發(fā)明 , 楊國(guó)棟 ， 林 霖

(河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 河南洛陽(yáng)471003)

為探討自擬中藥復(fù)方對(duì)免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，將女貞子、菟絲子、熟地、蒲公英、甘草按一定比例配伍，制備水煎液(質(zhì)量濃度為1 g/mL)。將80只昆明系小鼠隨機(jī)分為5組(空白對(duì)照組、免疫抑制模型組和中藥復(fù)方高、中、低劑量組)，空白對(duì)照組和免疫抑制模型組小鼠灌服蒸餾水(0.2 mL/只)，復(fù)方高、中、低劑量組小鼠分別灌服300 mg/只、200 mg/只、100 mg/只的復(fù)方水煎液，連續(xù)14 d。除空白對(duì)照組外，其他各組小鼠于給藥的第1、3、5、7天皮下注射地塞米松(30 mg/kg體重)。試驗(yàn)第20天，將所有小鼠進(jìn)行眼球采血，剖殺，稱量體質(zhì)量、胸腺重、脾臟重，計(jì)算胸腺、脾臟指數(shù)；分離血清，測(cè)定血清中免疫球蛋白G(IgG)、溶菌酶、白細(xì)胞介素2(IL-2)、白細(xì)胞介素4(IL-4)和干擾素γ(INF-γ)的含量。結(jié)果顯示，與免疫抑制模型組相比，復(fù)方中劑量組能夠顯著增加小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)，提高小鼠血清中IgG、溶菌酶、IL-2、INF-γ的含量；而對(duì)IL-4含量無(wú)顯著影響?？梢缘贸觯鹤詳M復(fù)方水提液能夠明顯改善免疫抑制小鼠的免疫功能，且這種調(diào)節(jié)作用與給藥劑量有一定相關(guān)性。

中藥 ； 小鼠 ； 免疫器官指數(shù) ； IgG ； 溶菌酶 ； 細(xì)胞因子

近年來(lái)，在我國(guó)畜牧業(yè)生產(chǎn)中，畜禽免疫抑制正逐漸成為養(yǎng)殖場(chǎng)最為普遍的頭號(hào)養(yǎng)殖難題，一些免疫抑制病，如豬的藍(lán)耳病、圓環(huán)病毒病，禽的馬立克病、傳染性腔上囊病等，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中流行較廣，對(duì)畜牧業(yè)的影響相當(dāng)嚴(yán)重。防治這類(lèi)疫病的根本原則是使動(dòng)物機(jī)體較低的免疫功能恢復(fù)，提高機(jī)體免疫力。目前有很多關(guān)于免疫增強(qiáng)劑的研究，其中中藥類(lèi)免疫增強(qiáng)劑，因其來(lái)源廣泛、安全性高和調(diào)節(jié)機(jī)體陰陽(yáng)平衡，符合無(wú)公害健康養(yǎng)殖的趨勢(shì)，成為研究熱點(diǎn)之一[1]。近些年,中藥提取物是研究較多的中藥類(lèi)免疫增強(qiáng)劑，然而批量生產(chǎn)中藥提取物相對(duì)繁瑣，生產(chǎn)代價(jià)較高，很難在畜禽養(yǎng)殖中推廣應(yīng)用。中藥復(fù)方是協(xié)同作用的基礎(chǔ)，有利于發(fā)揮中藥配伍的優(yōu)勢(shì)，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，更適合應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)。本試驗(yàn)選擇了幾種具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用的中藥：女貞子、菟絲子、熟地、蒲公英、和甘草[2-6]，配伍組成復(fù)方，所選中藥具有調(diào)補(bǔ)陰陽(yáng)，清熱散癰的作用，且常見(jiàn)、廉價(jià)，能夠降低用藥成本。本試驗(yàn)擬通過(guò)觀察不同劑量的復(fù)方水提液對(duì)免疫抑制小鼠幾項(xiàng)免疫指標(biāo)的影響，初步評(píng)價(jià)此自擬復(fù)方對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用，從而為進(jìn)一步研究此中藥復(fù)方對(duì)畜禽的免疫調(diào)節(jié)作用提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試動(dòng)物 昆明系小鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量為18±2 g。購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 中藥和主要試劑 女貞子、菟絲子、熟地、蒲公英、甘草，購(gòu)自張仲景大藥房；地塞米松注射液(吉林敖東藥業(yè)生產(chǎn))；小鼠免疫球蛋白G(IgG)ELISA試劑盒，小鼠溶菌酶試劑盒，購(gòu)自上海勁馬生物有限公司；小鼠白細(xì)胞介素2(IL-2)ELISA試劑盒，小鼠白細(xì)胞介素4(IL-4)ELISA試劑盒，小鼠γ干擾素(INF -γ)ELISA試劑盒，購(gòu)自上海邦奕商貿(mào)公司。

1.3 中藥復(fù)方水煎液的制備 女貞子30 g、菟絲子20 g、熟地20 g、蒲公英30 g、甘草20 g，加水適量，浸泡1 h后煮沸，改用文火煎30 min，濾出煎液，藥渣再加水煎煮，過(guò)濾，合并兩次濾液，濃縮至每1 mL藥液含生藥1 g(1 g/mL)，備用。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物的分組及處理 購(gòu)回的小鼠在安靜、清潔的條件下飼養(yǎng)，給予潔凈營(yíng)養(yǎng)飼料，先飼喂5-7 d以使其適應(yīng)。將80只昆明系小鼠隨機(jī)分為5組，每組16只(雌雄各半且分籠飼養(yǎng)，每籠8只)，分別為空白對(duì)照組、免疫抑制模型組和中藥復(fù)方高、中、低劑量組?？瞻讓?duì)照組和免疫抑制模型組小鼠灌服蒸餾水(0.2 mL/只)，復(fù)方高中低劑量組小鼠分別灌服不同劑量的復(fù)方水煎液，劑量為300 mg/只、200 mg/只、100 mg/只，連續(xù)14 d。除空白對(duì)照組皮下注射生理鹽水外，其他各組小鼠于給藥的第1,3,5,7天皮下注射地塞米松(40 mg/kg)。

1.5 小鼠體質(zhì)量、胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)的測(cè)定 各組小鼠采血后處死，稱取體質(zhì)量，解剖小鼠，取其脾臟、胸腺，用吸水紙浸干表面血液，稱重，記錄。計(jì)算小鼠胸腺、脾臟指數(shù)：胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量(mg/g)，脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量(mg/g)。

1.6 小鼠血清中免疫球蛋白G(IgG)、溶菌酶含量的測(cè)定 試驗(yàn)第20天，對(duì)各組小鼠進(jìn)行眼球采血。血液靜置待凝固，2500 r/min離心5 min，分離血清，備用。按照說(shuō)明書(shū)步驟操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。

1.7 小鼠血清中IL-2、IL-4、INF -γ含量的測(cè)定 按照說(shuō)明書(shū)步驟操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。

1.8 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)以Means ±SD表示，并用SPSS軟件進(jìn)行Duncan′分析，判斷結(jié)果差異是否顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 自擬復(fù)方對(duì)小鼠體質(zhì)量、胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)的影響 本試驗(yàn)測(cè)定了自擬復(fù)方對(duì)免疫抑制小鼠體質(zhì)量、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響，結(jié)果顯示，復(fù)方高、中、低劑量組小鼠的體質(zhì)量顯著高于模型組(P<0.05)，中劑量組小鼠的平均體質(zhì)量比模型組高3.03 g；復(fù)方高、中劑量組的脾臟指數(shù)顯著高于模型組(P<0.05)，與空白對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)中劑量組小鼠的脾臟指數(shù)比模型組高0.47；復(fù)方高、中、低劑量組的胸腺指數(shù)均顯著高于模型組(P<0.05)，高劑量組小鼠的胸腺指數(shù)比模型組高0.63，但復(fù)方組都顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)?？梢?jiàn)中劑量的復(fù)方可以提高免疫抑制小鼠的體質(zhì)量和脾臟指數(shù)，使其接近正常小鼠的水平；對(duì)胸腺指數(shù)也有一定的提高，但仍顯著低于正常小鼠(見(jiàn)表1)。

表1 自擬復(fù)方對(duì)小鼠體質(zhì)量、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響

注：同行數(shù)據(jù)中肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下表同

2.2 自擬復(fù)方對(duì)小鼠血清中IgG含量及溶菌酶含量的影響 本試驗(yàn)用ELISA法測(cè)定了各組小鼠血清中IgG和溶菌酶的含量。結(jié)果顯示，復(fù)方高、中、低劑量組小鼠血清中的IgG含量均明顯高于模型組(P<0.05)，復(fù)方中劑量組小鼠的IgG含量比模型組高41.79 ng/mL，且與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)；復(fù)方中、低劑量組小鼠血清中溶菌酶含量均明顯高于模型組(P<0.05)，中劑量組小鼠的溶菌酶含量比模型組高0.87 ng/mL，且與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)?？梢?jiàn)中劑量的復(fù)方可以提高免疫抑制小鼠血清中的IgG和溶菌酶的含量，使其接近正常小鼠的水平(見(jiàn)表2)。

表2 自擬復(fù)方對(duì)小鼠血清中IgG和溶菌酶含量的影響

2.3 自擬復(fù)方對(duì)小鼠血清中IL-2、IL-4、INF-γ含量的影響 本試驗(yàn)采用ELISA法測(cè)定了各組小鼠血清中IL-2、IL-4、INF-γ的含量。復(fù)方高、中、低劑量組小鼠血清中IL-2含量顯著高于模型組(P<0.05)，中劑量組比模型組高8.27 pg/mL，與空白對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)；復(fù)方高、中、低劑量組小鼠血清中IL-4含量低于模型組，但差異不顯著(P>0.05)，與空白對(duì)照組差異也不顯著(P>0.05)； 復(fù)方高、中劑量組小鼠血清中INF-γ含量顯著高于模型組(P<0.05)，中劑量組比模型組高6.23 pg/mL，與空白對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)?？梢?jiàn)中劑量的復(fù)方可以提高免疫抑制小鼠血清中IL-2、INF-γ的含量，使其接近正常小鼠的水平，但是對(duì)IL-4無(wú)顯著影響(見(jiàn)表3)。

表3 自擬復(fù)方對(duì)小鼠血清中幾種細(xì)胞因子含量的影響

3 討論

3.1 自擬復(fù)方對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響 脾臟和胸腺是機(jī)體中重要的淋巴器官，兩者的功能與機(jī)體免疫狀況緊密相關(guān)。免疫器官指數(shù)是衡量機(jī)體免疫狀態(tài)的初步指標(biāo)。在本試驗(yàn)中，注射地塞米松的小鼠體質(zhì)量、脾臟和胸腺指數(shù)均顯著低于正常小鼠，尤其以胸腺萎縮最為嚴(yán)重。灌服自擬復(fù)方后可以提高免疫抑制小鼠的體質(zhì)量及免疫器官指數(shù)，其中復(fù)方中劑量組的體質(zhì)量、脾臟指數(shù)和對(duì)照組小鼠相近，差異不顯著。但是胸腺萎縮嚴(yán)重，灌服中藥復(fù)方后，小鼠的胸腺也未能恢復(fù)到空白對(duì)照組小鼠的水平。有報(bào)道[7]杜仲葉多糖可以顯著提高免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)，且達(dá)到正常小鼠的水平。與本試驗(yàn)結(jié)果不一致。但Ahmed S A曾報(bào)道[8]，糖皮質(zhì)激素對(duì)免疫系統(tǒng)有明顯的抑制作用，并且以胸腺的細(xì)胞凋亡最為明顯，正常組織被破壞，且恢復(fù)較慢?？梢越忉尡驹囼?yàn)中為何脾臟指數(shù)基本恢復(fù)到正常水平，而胸腺指數(shù)未能恢復(fù)到正常。本試驗(yàn)證明了自擬復(fù)方對(duì)地塞米松引起的小鼠胸腺和脾臟萎縮具有一定的抵抗作用，從而間接的改善免疫抑制小鼠的免疫功能。

3.2 自擬復(fù)方對(duì)小鼠血清中IgG和溶菌酶的影響 IgG是血清主要的抗體成分，約占血清免疫球蛋白總量的75%。主要是機(jī)體體液免疫應(yīng)答中產(chǎn)生的。溶菌酶來(lái)自單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞，能溶解某些細(xì)菌，該酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，自擬復(fù)方高中低劑量均可以提高免疫抑制小鼠血清中IgG和溶菌酶含量，其中復(fù)方中劑量組與空白對(duì)照組小鼠的IgG含量相近，差異不顯著。免疫小鼠血清中IgG和溶菌酶含量的增加可以在一定程度上反映小鼠機(jī)體免疫能力的提高，合適劑量的自擬復(fù)方水提液可以使免疫抑制小鼠血清中免疫球蛋白和溶菌酶基本恢復(fù)到正常水平，進(jìn)而改善小鼠的免疫狀況。

3.3 自擬復(fù)方對(duì)小鼠血清中幾種細(xì)胞因子含量的影響 細(xì)胞因子能介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，檢測(cè)細(xì)胞因子水平可以反映機(jī)體的免疫狀態(tài)。IL-2 主要由TH1 細(xì)胞分泌，參與細(xì)胞免疫反應(yīng); IL-4 主要由TH2 細(xì)胞分泌，參與體液免疫反應(yīng)。IFN-γ主要由活化的Th1 細(xì)胞和NK 細(xì)胞所產(chǎn)生，并通過(guò)增強(qiáng)Th1 細(xì)胞活性而提高細(xì)胞免疫功能。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，中劑量的自擬中藥復(fù)方可顯著增加免疫抑制小鼠血清中IL-2、IFN-γ含量，使其基本達(dá)到空白對(duì)照組健康小鼠的水平。表明自擬復(fù)方對(duì)免疫抑制小鼠的免疫功能具有一定的調(diào)節(jié)作用。盧舜飛等[9]也報(bào)道，剎毒草合劑可通過(guò)提高免疫抑制小鼠血清中IL-2、TNF-α及IFN-γ的濃度而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。在本試驗(yàn)中地塞米松使小鼠血清中IL-4的含量升高，自擬復(fù)方使免疫抑制小鼠血清中IL-4的含量降低，但差異不顯著，中藥組與空白對(duì)照組差異也不顯著。高光平等[10]試驗(yàn)證明，紫黃散和扶正解毒散均能明顯提高免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL-4 和IFN-γ 水平，與本試驗(yàn)結(jié)果不一致。也有報(bào)道[11]免疫抑制劑升高小鼠脾細(xì)胞中IL-4，中藥歸參湯可以降低IL-4水平，與本試驗(yàn)結(jié)果有一定的相似性。推測(cè)免疫抑制劑對(duì)機(jī)體IL-4的影響存在不確定性，但是最終機(jī)體內(nèi)IL-2、IL-4的含量變化要使TH1/TH2達(dá)到一定平衡，具體調(diào)節(jié)機(jī)制還有待研究。

綜上所述，自擬中藥復(fù)方能夠改善免疫抑制小鼠的免疫功能，且這種增強(qiáng)作用與中藥復(fù)方的用藥劑量有一定相關(guān)性。本試驗(yàn)結(jié)果可以為進(jìn)一步的研究提供理論參考。

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The Effects of Self-made Chinese Medicine Compound on Immune Function of Immunosuppressive Mice

QIU Yan, DONG Fa-ming, YANG Guo-dong， LIN Lin

(College of Animal technology, Henan Science and Technology University, Luoyang 471003, China)

In order to investigate the immune regulation effect of a Chinese herbal compound by our own formulation on immune suppression mice,we selected Ligustrum lucidum,dodder seed,radix rehmanniae, dandelion and licorice,which were prepared for water decoction(concentration of 1g/ml) according to a certain proportion.Eighty Kunming rats were randomly divided into 5 groups:control group,immune suppression model group and traditional Chinese medicine compound group with high,medium and low doss.The mice of control group and immune suppression model group were administrated with distilled water (each 0.2ml).Each mouse from Chinese medicine compound with high, medium or low dose group was given different doses of the water decoction(300 mg, 200 mg and 100 mg,respectively)for 14 consecutive days.The mice except control group were injected with dexamethasone (30mg/kg) subcutaneously,at the 1st,3rd,5th,and 7th day after being given the water decoction.Blood was gained from the eyeballs of mice on the 20th day of the experiment,and then the mice were killed and body weight, thymus gland weight and spleen weight,were weighed and thymus index and spleen index were calculated.The content of serum immune globulin protein G (IgG), lysozyme, leukocyte mediated IL 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4) and interferon gamma (INF gamma) were determined after the serum separation.The experiment results showed that compared with the immune suppression model group,the Chinese medicine compound group of medium dose significantly increased the thymus and spleen index of mice, increased the content of serum IgG, lysozyme, IL-2, IFN gamma,but no significant effect on the content of IL-4.In conclusion,the Chinese herbal compound water extract by our own formulation can obviously improve the immune function of the immune suppression mice,and there is a certain correlation with the dose.

self-made Chinese medicine compound , mice , the index of immune organ , IgG , Lysozyme , cytokine

2015-08-18

河南科技大學(xué)博士啟動(dòng)基金(09001240)

邱妍 (1980-)，女，副教授，博士，主要從事中獸藥相關(guān)研究，E-mail：qiuyan135@sina.com

S853.7

A

0529-6005(2016)11-0070-04