牛建蕊 ， 高志強(qiáng) ， 蒲 靜 ， 張 偉， 劉 環(huán) ， 劉文曉 ， 張鶴曉

(1. 北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司, 北京懷柔101400 ； 2. 北京出入境檢驗(yàn)檢疫局， 北京朝陽100026)

動(dòng)物RNA病毒檢測關(guān)鍵試劑—反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV RTase)的制備

牛建蕊1， 高志強(qiáng)2， 蒲 靜2， 張 偉2， 劉 環(huán)2， 劉文曉1， 張鶴曉2

(1. 北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司, 北京懷柔101400 ； 2. 北京出入境檢驗(yàn)檢疫局， 北京朝陽100026)

反轉(zhuǎn)錄酶是動(dòng)物RNA病毒分子診斷用到的關(guān)鍵試劑之一。 為獲得純度高、 活性高、 制備簡單經(jīng)濟(jì)的M-MLV RTase， 本試驗(yàn)將M-MLV RTase的基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化， 合成并構(gòu)建表達(dá)載體。 將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coliRosetta宿主菌種， 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后實(shí)現(xiàn)M-MLV RTase的可溶性表達(dá)。 利用Ni2+柱親和層析純化載有6xHis標(biāo)記的重組M-MLV RTase， 對(duì)重組酶進(jìn)行Western Blotting試驗(yàn)， 鑒定為M-MLV RTase。 通過對(duì)動(dòng)物流感病毒RNA的普通RT-PCR和熒光RT-PCR檢測來評(píng)價(jià)重組酶的活性并估測其活性單位。 將活性單位相當(dāng)?shù)闹亟M酶和商品酶進(jìn)行比較， 結(jié)果顯示，制備的重組酶活性高， 對(duì)不同濃度病毒RNA的檢測結(jié)果與商品酶相當(dāng)。 研制的M-MLV RTase可以用于動(dòng)物RNA病毒的分子診斷。

M-MLV RTase； 表達(dá)； 純化； RT-PCR

動(dòng)物疫病診斷和檢測不外乎兩大類方法，一是針對(duì)血清中抗體的血清學(xué)檢測方法，一是針對(duì)病原體的病原學(xué)檢測方法?？贵w檢測可以評(píng)估使用疫苗后的情況，以及判斷是否曾經(jīng)感染過某種動(dòng)物疫病，病原學(xué)檢測是確定動(dòng)物攜帶病原體直接證據(jù)的方法。病原體分離的優(yōu)點(diǎn)是結(jié)果準(zhǔn)確，是病原診斷檢測的金標(biāo)方法，缺點(diǎn)是耗時(shí)長，需要幾天甚至幾周才能出結(jié)果，而且還伴隨生物安全問題，需要一定生物安全級(jí)別的實(shí)驗(yàn)室才能進(jìn)行。

隨著分子診斷技術(shù)的出現(xiàn)，病原學(xué)診斷檢測技術(shù)得到突飛猛進(jìn)的發(fā)展，病原學(xué)診斷檢測技術(shù)已經(jīng)達(dá)到一個(gè)新的高度，不再單單依靠病原分離就能對(duì)動(dòng)物疫病做出準(zhǔn)確診斷。動(dòng)物RNA病毒檢測目前應(yīng)用最廣的技術(shù)為RT-PCR技術(shù)、熒光RT-PCR技術(shù)、核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等，不論哪種分子診斷技術(shù)，都用到關(guān)鍵試劑-反轉(zhuǎn)錄酶。反轉(zhuǎn)錄酶又稱依賴RNA 的DNA 聚合酶，常見的反轉(zhuǎn)錄酶主要有M-MLV RTase和AMV RTase。由于反轉(zhuǎn)錄酶質(zhì)量參差不齊，不同品牌的反轉(zhuǎn)錄酶效果不一，同一品牌的反轉(zhuǎn)錄酶不同批次效果也不同，導(dǎo)致組裝的試劑盒質(zhì)量受到影響。

為保證動(dòng)物RNA病毒的檢測質(zhì)量，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究表達(dá)純化M-MLV RTase，并對(duì)其進(jìn)行活性評(píng)價(jià)，以便更好地完善動(dòng)物RNA病毒分子診斷檢測，保證研發(fā)的試劑盒的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 菌株與載體E.coliRosetta，購自TaKaRa公司；pET-21b，購自Novagen公司。

1.2 主要試劑 商品酶M-MLV RTase，購自Promega公司；Ni-NTA His·Bind樹脂，購自美國QIAGEN；抗His標(biāo)簽單抗，購自Novagen公司和Thermo公司；離心超濾管，購自 Millipore公司。

1.3 目標(biāo)序列的優(yōu)化、合成及表達(dá)載體的構(gòu)建 對(duì)從NCBI下載的M-MLV RTase基因序列[1]進(jìn)行利于其在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的密碼子優(yōu)化后，委托深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成并連接到pET-21b載體中，獲得重組表達(dá)載體pET-21b-MMLV-RT，轉(zhuǎn)化到E.coliRosetta，用于表達(dá)。

1.4 重組蛋白的可溶性表達(dá) 挑取含有pET-21b-MMLV-RT單菌落接種到5 mL含有100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃ 過夜培養(yǎng)獲得母液，按照2%接種量接種到500 mL 上述培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600在0.2～0.8之間，然后根據(jù)不同的培養(yǎng)時(shí)間、IPTG濃度以及誘導(dǎo)時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行表達(dá)，摸索最佳誘導(dǎo)條件。

1.5 重組蛋白的純化與鑒定[2-3]

1.5.1 親和層析 收集誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌體，超聲破碎、離心，將獲得可溶性蛋白上清經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。按說明書進(jìn)行親和層析純化，收集流出液、漂洗液及洗脫液。

1.5.2 超濾 使用Amicon Ultra-15 mL離心超濾管對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行超濾，達(dá)到濃縮和置換蛋白保存液的目的。

1.5.3 Western Blotting檢測 利用抗His的單抗對(duì)帶有His標(biāo)簽的重組蛋白進(jìn)行Western Blotting檢測，以鑒定重組蛋白表達(dá)。

1.6 活性檢測 用動(dòng)物A型流感病毒M基因的一對(duì)引物來擴(kuò)增流感病毒M基因，并將獲得的目的片段進(jìn)行序列比對(duì)，通過普通RT-PCR檢驗(yàn)制備重組酶的活性。用重組M-MLV RTase取代動(dòng)物A型流感病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒的反轉(zhuǎn)錄酶，通過熒光RT-PCR來檢測重組酶的活性。通過對(duì)重組酶與商品酶的熒光RT-PCR擴(kuò)增對(duì)比，來估算重組酶的活性單位。

1.7 靈敏度比較 將相當(dāng)活性的重組M-MLV RTase與商品酶分別對(duì)10倍倍比稀釋的動(dòng)物A型流感病毒RNA進(jìn)行普通RT-PCR與熒光RT-PCR檢測，評(píng)價(jià)重組酶的檢測靈敏度。

2 結(jié)果

2.1 重組 M-MLV RTase的誘導(dǎo)表達(dá)、純化與鑒定 最終表達(dá)菌在OD600為0.5，加入終濃度0.4 mmol/L的 IPTG，25 ℃低溫誘導(dǎo)12 h的條件下獲得可溶性的重組蛋白，圖1箭頭為上清表達(dá)的目的蛋白。重組蛋白的純化結(jié)果見圖2，圖中泳道4到7為4次洗脫后收集到目的蛋白。對(duì)目的蛋白進(jìn)行超濾，最終獲得10 mL保存在保存緩沖液中的蛋白液，結(jié)果見圖3。Western Blotting的鑒定結(jié)果見圖4，出現(xiàn)了大小在75 kD左右的目的條帶。

圖1 重組蛋白的可溶性誘導(dǎo)表達(dá)

圖2 重組蛋白的純化梯度咪唑漂洗

M:Marker; 1:穿過液； 2～3: 20 mmol/L咪唑洗滌液； 4～7:250 mmol/L咪唑洗脫液

圖3 重組蛋白的超濾

1:超濾前； 2:超濾后; M:Marker

圖4 重組蛋白Western-Blotting鑒定

2.2 重組 M-MLV RTase的RT-PCR活性檢測

2.2.1 普通RT-PCR 重組酶及商品酶通過普通RT-PCR均能擴(kuò)增出目的片段，將目的片段送測，測得序列與模板序列比對(duì)均100%同源，說明重組酶具有反轉(zhuǎn)錄酶活性。

2.2.2 熒光RT-PCR 中插彩版圖5可見，制備的重組酶與商品酶均能獲得熒光RT-PCR擴(kuò)增曲線。為測定重組酶活性單位，以相同量的商品酶作為對(duì)照，將倍比稀釋后的重組酶進(jìn)行熒光RT-PCR。結(jié)果見中插彩版圖6，由于重組酶加入量過高時(shí)，會(huì)抑制Taq DNA聚合酶的活性[4]，導(dǎo)致擴(kuò)增曲線低，隨著稀釋倍數(shù)的增加，重組酶的擴(kuò)增曲線逐漸升高，說明我們未稀釋或稀釋度所加酶量都可能超過了最佳用量；但當(dāng)稀釋過高時(shí)，酶濃度過低，所以擴(kuò)增曲線下降，Ct值也開始升高。中插彩版圖6中1為0.5 μL(200 U/μL)商品酶的擴(kuò)增曲線，Ct值為20.10；4為0.5 μL 4倍稀釋重組酶的PCR擴(kuò)增曲線，Ct值為20.42，這兩個(gè)酶的擴(kuò)增效果相當(dāng)，由此可知制得重組酶4倍稀釋后至少每微升有200 U的酶活，與商品酶活性相當(dāng)。

2.3 重組M-MLV RTase與商品酶的靈敏度比較 在普通RT-PCR檢測中，相當(dāng)活性單位的重組酶與商品酶均可檢測到稀釋到10-4的動(dòng)物A型流感病毒RNA，但重組酶擴(kuò)增條帶的亮度略高；在熒光RT-PCR檢測中，相當(dāng)活性單位的重組酶和商品酶均可檢測到10-6稀釋度的病毒RNA，但重組酶的擴(kuò)增曲線要高于商品酶，結(jié)果見中插彩版圖7。

3 討論

已有報(bào)道重組M-MLV RTase在大腸桿菌的表達(dá)，但表達(dá)量低、純化步驟復(fù)雜[5-6-7]。針對(duì)上述問題，我們首先通過對(duì)目標(biāo)序列密碼子優(yōu)化和誘導(dǎo)條件摸索解決了可溶性表達(dá)量低的問題。再利用重組蛋白上的His標(biāo)簽進(jìn)行純化，通過超濾濃縮，減少酶活性的損失，解決純化復(fù)雜，酶活性降低的問題。試驗(yàn)表明，本研究構(gòu)建的重組表達(dá)載體可溶性表達(dá)量高、易純化。

通過對(duì)動(dòng)物病毒RNA的普通RT-PCR和熒光RT-PCR檢測，驗(yàn)證了重組M-MLV RTase的反轉(zhuǎn)錄活性。熒光RT-PCR試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組酶濃度過高時(shí)，會(huì)出現(xiàn)抑制反應(yīng)的現(xiàn)象，在普通RT-PCR檢測中不明顯，說明制得的酶濃度高。為獲得相同活性單位的重組酶進(jìn)行下游比較試驗(yàn)，我們對(duì)重組酶進(jìn)行倍比稀釋后與商品酶對(duì)比估測重組酶的活性單位，經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)制得活性單位為200 U/μL的重組酶。將活性單位相同的重組酶與商品酶對(duì)不同稀釋倍數(shù)的動(dòng)物A型流感病毒RNA進(jìn)行檢測，評(píng)價(jià)重組酶的靈敏度，結(jié)果顯示，重組酶與商品酶的靈敏度相當(dāng)，對(duì)低濃度的病毒RNA均可檢出。

動(dòng)物RNA病毒分子診斷及檢測的關(guān)鍵試劑-反轉(zhuǎn)錄酶的質(zhì)量是影響結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素。目前市場銷售的商品酶，價(jià)格高，保質(zhì)期短，不能滿足動(dòng)物疫病病原熒光RT-PCR檢測試劑盒的需求，因?yàn)闉榱私鉀Q這一技術(shù)難題，我們進(jìn)行了反轉(zhuǎn)錄酶的制備技術(shù)研究，結(jié)果顯示，本制備技術(shù)操作簡單、耗時(shí)短、產(chǎn)量高，獲得的重組酶活性高、靈敏度高、穩(wěn)定性好，可用于動(dòng)物病原分子診斷，適于大量推廣。

[1] Georgiadis M M, Jessen S M, Ogata C M,etal. Mechanistic implications from the structure of a catalytic fragment of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase[J].Structure， 1995，3：879-892．

[2] Mirza M R, Rainer M, Messner C B,etal. A new type of metal chelate affinity chromatography using trivalent lanthanide ions for phosphopeptide enrichment[J]. Analyst，2013，138：2995-3004．

[3] Petty K J. Metal-chelate affinity chromatography[J]. Curr Protoc Protein Sci，2001，Chapter 9：4-9．

[4] Sellner L N, Coelen R J, Mackenzie J S. Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity[J]. Nucleic Acids Res，1992，20：1487-1490．

[5] Kotewicz M L, D'Alessio J M, Driftmier K M,etal.Cloning and overexpression of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase in Escherichia coli[J].Gene，1985，35：249-258．

[6] Sun D, Jessen S, Liu C,etal. Cloning, expression, and purification of a catalytic fragment of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase: crystallization of nucleic acid complexes[J]. Protein Sci，1998，7(7)：1575-1582．

[7] Chen Y, Xu W, Sun Q. A novel and simple method for high-level production of reverse transcriptase from Moloney murine leukemia virus (MMLV-RT) in Escherichia coli[J]. Biotechnol Lett，2009，31(7)：1051-1057．

Preparations of the M-MLV RTase as the key reagent for the detection of animal RNA viruses

NIU Jian-rui1, GAO Zhi-qiang2, PU Jing2, ZHANG Wei2, LIU Huan2, LIU Wen-xiao1, ZHANG He-xiao2

(1. Beijing Senkang Biotech Development Co., Ltd, Beijing 101400, China；2. Beijing Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Beijing 100026， China)

Reverse Transcriptase was used as one of the key reagents for Animal RNA virus molecular diagnosis. In order to obtain high purity, high activity, economy and easy preparation of M-MLV RTase, the codons of the sequence of M-MLV RTase were optimized, and the expression vector was constructed and transformed into E.coli Rosetta which was induced by IPTG. Soluble M-MLV RTase expression was achieved, and the M-MLV RTase with a tag of 6 x His was purified by Ni2+affinity chromatograph and identified through Western blotting. The activity and activity unit of the recombinant enzyme were evaluated through the detection of animal influenza virus by ordinary RT-PCR and real time RT-PCR. Compared to commercial Enzyme, the recombinant M-MLV RTase has the same efficasy in testing the influenza virus in different dilutions. The recombinant M-MLV RTase can be used in the diagnosis of animal RNA viruses.

M-MLV RTase; expression; purification; RT-PCR

ZHANG He-xiao

2015-11-12

國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014IK232)

牛建蕊(1983- )，女，博士，主要從事動(dòng)物疫病檢測技術(shù)研究，E-mail：jrniu@126.com

張鶴曉，E-mail:aqlzhx@126.com

S852.65+93

A

0529-6005(2016)11-0026-03