劉 林，周慧聰，王秋娟，陳思靜，馬永平

(重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心，生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，重慶 400016)

大腸不耐熱腸毒素B亞單位佐劑活性相關(guān)蛋白的篩選

劉 林，周慧聰，王秋娟，陳思靜，馬永平

(重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心，生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，重慶 400016)

目的 通過對大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位相互作用蛋白的分析，探討LTB佐劑活性的分子機制。方法 純化的LTB蛋白和生理鹽水分別處理RAW 264.7細胞，pull-down實驗分離與LTB有相互作用的蛋白分子，質(zhì)譜鑒定這些相互作用蛋白；免疫熒光和Western blot分析驗證與LTB相互作用蛋白在細胞內(nèi)的相互作用。結(jié)果 通過質(zhì)譜鑒定了25種可能與LTB存在相互作用的蛋白分子，并構(gòu)建了其相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，篩選出可能與LTB免疫調(diào)節(jié)作用相關(guān)的蛋白分子；免疫熒光結(jié)果顯示神經(jīng)節(jié)苷脂能阻斷LTB進入RAW 264.7細胞內(nèi)，LTB在細胞內(nèi)與GM130存在相互作用，而Vimentin在生理狀態(tài)下與LTB不存在相互作用；LTB處理RAW 264.7細胞12 h后，β-actin表達上調(diào)，Hspd1表達無變化。結(jié)論 LTB佐劑活性的發(fā)揮是通過與免疫細胞表面GM1結(jié)合，引起內(nèi)吞，并以小泡的形式到達高爾基體，通過高爾基體的加工。最終通過與Jup結(jié)合進而作用于TCF/LEF，引起B(yǎng)cl-2、IL-6、Runx3等基因表達的變化，發(fā)揮促進T細胞和B細胞的增殖分化及活化、分泌細胞因子及免疫球蛋白的作用。

LTB；RAW 264.7；相互作用蛋白；免疫；佐劑；內(nèi)吞

大腸桿菌不耐熱腸毒素由產(chǎn)毒型大腸埃希菌(ETEC)產(chǎn)生，因其不耐熱，在60℃處理30 min即被破壞，故稱作不耐熱腸毒素(LT)[1-2]。LT 是一類六聚體大分子，由1個 A 亞基 (LTA) 和5個B亞基 (LTB) 組成，結(jié)構(gòu)和功能與霍亂毒素相似[3]。LTB作為LT的非毒性亞基，能刺激機體產(chǎn)生強烈的黏膜和系統(tǒng)免疫[4]。LTB的免疫調(diào)節(jié)作用包括促進 Th1 和 Th2 型細胞反應(yīng)的細胞因子的表達，CD8+T細胞的凋亡和CD4+T細胞的增殖；使B細胞活化的MHCⅡ、ICAM-1、CD25、CD40分子表達增加，影響巨噬細胞[5-6]和B細胞的抗原處理和呈遞過程[7,8]，以及DC的發(fā)育和成熟，使DC細胞更好的發(fā)揮抗原遞呈的作用[9]，從而達到增強機體對抗原的免疫應(yīng)答[10-12]。然而對于LTB引起這些免疫調(diào)節(jié)變化的機制尚不清楚，因而本實驗選用小鼠單核細胞巨噬細胞白血病細胞株RAW 264.7[13]作為研究對象，研究 LTB 介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 LTB質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建并保存；E.coliBL21(DE3)由本教研室保存；原核表達載體pET-32a購自Invitrogen公司；RAW 264.7細胞源于本實驗室免疫學(xué)課題組陳全教授饋贈；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自Hyclon公司；Protein Interaction Kit購自Thermo Fisher公司；兔源GM130抗體、兔源Vimentin抗體、兔源Hspd1抗體和兔源β-actin抗體均購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，鼠源抗His標(biāo)簽抗體、羊抗兔DY488綠色熒光抗體和羊抗鼠DY549紅色熒光抗體購自Santa Cruz公司；Toxin Eraser購自金斯瑞生物科技有限公司；蛋白純化磁珠購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 LTB融合蛋白的純化鑒定 透析袋預(yù)處理:依次用10 mmol·L-1Na2CO3溶液和10 mmol·L-1EDTA-Na溶液各煮沸15 min，蒸餾水徹底洗凈備用；誘導(dǎo)表達LTB融合蛋白，收集菌體，提取并純化LTB蛋白，純化后蛋白經(jīng)透析復(fù)性并濃縮后，用Toxin Eraser Kit去除內(nèi)毒素，用BCA法測定其濃度，SDS-PAGE檢測純化蛋白純度及其分子質(zhì)量大小。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及Pull-down實驗 RAW 264.7細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng),待細胞密度達到60%～70%，用無血清DMEM處理8 h使細胞同步化，實驗組加入100 mg·L-1LTB蛋白，對照組加等體積生理鹽水，處理12 h后收集細胞，提取細胞蛋白，測蛋白濃度。取等量的純化的LTB融合蛋白和提取的兩組細胞蛋白(保證LTB融合蛋白過量)，用Protein Interaction Kit做pull-down實驗，分離與LTB有相互作用的蛋白分子，SDS-PAGE檢測分離得到蛋白的差異，并將分離得到的相互作用蛋白進行質(zhì)譜鑒定，對鑒定結(jié)果進行分析處理。

1.2.3 免疫熒光驗證生理情況下與LTB存在相互作用的蛋白 RAW 264.7細胞于24孔板中爬片，待細胞密度達到50%～60%，分為4個組，每組3個孔，第1組只加生理鹽水，第2組和第3組加10 μg LTB融合蛋白，第4組加已用神經(jīng)節(jié)苷脂(GM)封閉30 min的LTB融合蛋白(LTB ∶GM=1 ∶5)，分別收集處理時間為5、15、30 min的爬片，快速洗滌后，馬上用4%多聚甲醛固定，PBS洗5次，每次5 min；2% triton 100處理10 min，洗3次；加山羊血清于37℃孵箱，封閉30 min；一抗37℃孵育2 h，洗滌5次；二抗避光37℃孵育90 min，熒光顯微鏡檢測結(jié)果。

1.2.4 Western blot 檢測相互作用蛋白Hspd1和β-actin表達水平 收集LTB融合蛋白處理12 h的RAW 264.7細胞，提取細胞蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。按每孔50 μg蛋白量上樣，經(jīng)12% PAGE膠電泳分離后，將目的蛋白電轉(zhuǎn)于PVDF膜上，5% BSA封閉 2 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗3次，每次15 min，加二抗室溫搖床孵育2 h，ECL發(fā)光檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 LTB蛋白純化 SDS-PAGE結(jié)果顯示，純化得到的蛋白分子量約為30 ku，與LTB蛋白實際分子量大小一致(Fig 1)，表明獲得了高純度的LTB融合蛋白，可以用于后續(xù)實驗。

2.2 LTB抓取到的相互作用蛋白的SDS-PAGE檢測 SDS-PAGE 結(jié)果顯示，與對照組相比，LTB 處理組有明顯多于對照組的條帶，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明通過pull down捕獲到了與LTB有相互作用的蛋白分子(Fig 2)。

Fig 1 SDS-PAGE analysis of purified VP8 fusion protein and LTB fusion protein

1:Marker；2:VP8 fusion protein；3:LTB fusion protein

Fig 2 SDS-PAGE analysis of proteins interaction with LTB

1:Marker;2:Control group;3:Experimenal group;4:LTB fusion protein

2.3 LTB pull down蛋白的質(zhì)譜分析結(jié)果

2.3.1 初步篩選得到的相互作用蛋白及其功能性分析 將得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)進行篩選，標(biāo)準(zhǔn)要求鑒定出的蛋白大于閾值可信肽段數(shù)大于3，Unused(置信度)值大于 1.3，篩選得到的相互作用蛋白見Tab 2，共25個相互作用蛋白，其中有12個屬于Keratin蛋白家族，可信肽段數(shù)小于10的蛋白有9個，可信肽段數(shù)在10～20之間的共9個，可信肽段數(shù)大于20的共7個，并對其進行功能性分析，它們的功能見Tab 3。

Tab 1 The interacting proteins identified by MS

Tab 2 The analysis of interacting protein′s function

續(xù)表

ProteinsFunctionKeratin-78Contributestotheformationofthecytoskeleton,cel-lularcomponents,cytoskeletalintermediatefibersKeratin-79Contributestotheformationofthecytoskeleton,cel-lularcomponents,cytoskeletalintermediatefibers.Vimentinclass-Ⅲintermediatefilamentsfoundinvariousnon-epithelialcells,especiallymesenchymalcells.Vimen-tinisattachedtothenucleus,endoplasmicreticulum,andmitochondria,eitherlaterallyorterminallyDesmoplakinInvolvesintheorganizationofthedesmosomalcad-herin-plakoglobincomplexesintodiscreteplasmamembranedomainsandintheanchoringofintermedi-atefilamentstothedesmosomes.A-XactinContributestotheformationofthecytoskeleton,cel-lular,cytoskeletalintermediatefibers.Plakophilin-1Seemstoplayaroleinjunctionalplaques.Contributestoepidermalmorphogenesis.JupPlaysacentralroleinthestructureandfunctionofsubmembranousplaques.ActsasasubstrateforVE-PTPandisrequiredbyittostimulateVE-cadherinfunctioninendothelialcells.Canreplacebeta-catenininE-cadherin/cateninadhesioncomplexeswhichareproposedtocouplecadherinstotheactincytoskele-ton.PKMPyruvatekinase,oxidativedecompositionofglucoseandgenerationATP.Prss1Serinelikeenzymecatalyticactivity,proteinhydroly-sis.Ero1lproteinRedoxenzymeactivity,electrontransportchain,pro-tein.folding,intracellularproteintransport,endocy-tosisandeffluxHspd160kuheatshockprotein.Mayfacilitatethecorrectfoldingofimportedproteins.Carbamoyl-phosphatesynthetaseIGlutamyltransferaseactivity,hydrolaseactivity,lig-aseactivity,nitrideCompoundmetabolism,synthesisofbasecompounds,biologicalsynthesisofcellulara-minoacids.playsanimportantroleinremovingex-cessammoniafromthecell.AnnexinPlaysimportantrolesintheinnateimmuneresponseaseffectorofglucocorticoid-mediatedresponsesandregulatoroftheinflammatoryprocess.Hasanti-in-flammatoryactivity.Playsaroleinglucocorticoid-mediateddown-regulationoftheearlyphaseofthein-flammatoryresponse.Heterogeneousnu-clearribonucleopro-teinLLikelytoplayaroleinthenuclearmetabolismofhnRNAs,particularlyforpre-mRNAsthatcontaincytidine-richsequences.Canalsobindpoly(C)single-strandedDNA.Playsanimportantroleinp53/TP53responsetoDNAdamage,actingatthelevelofbothtranscriptionactivationandrepression.Ddx5Thetranslationinitiationfactor,translationregula-tion,RNAhelicase.Involvesinthealternativeregu-lationofpre-mRNAsplicing.

2.3.2 相互作用蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖 通過http://string-db.org/ 網(wǎng)站提供的分析工具對這些蛋白的相互作用進行了預(yù)測(Fig 3)。根據(jù)這些蛋白分子相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)有4個蛋白分子與其他蛋白分子沒有相互作用，因此推測這些蛋白分子與其他蛋白分子的相互作用可能還未被發(fā)現(xiàn)，或者是非特異性結(jié)合的蛋白分子。剩余的21種蛋白，以Jup為界限分為左右兩半，左邊的13種蛋白均為細胞骨架蛋白，11種屬于Keratin家族，剩下的2個分別是Pkp1，并且發(fā)現(xiàn)這些分子間的相互作用都比較強。右邊的蛋白以Jup為起始，以Ddx5、PKM、Anxa2 3個分子結(jié)束。

Fig 3 Analysis for volume of proteins captured by LTB fusion protein

*P<0.05vsNaCl

2.4 LTB在RAW 264.7細胞內(nèi)的免疫熒光定位 免疫熒光結(jié)果顯示，對照組(NaCl組)未加LTB處理，所以5、15、30 min細胞內(nèi)均未出現(xiàn)紅色熒光信號，而GM130標(biāo)記組和Vimentin標(biāo)記組細胞內(nèi)均有紅色熒光信號；Vimentin標(biāo)記組沒有與LTB相互作用的陽性信號，表明LTB在細胞內(nèi)與Vimentin蛋白不存在相互作用；而GM130標(biāo)記組有與LTB相互作用的橙色陽性信號(箭頭標(biāo)記)，而且隨著時間增加陽性信號增強，表明LTB是能夠進入巨噬細胞內(nèi)，且隨時間延長，進入細胞內(nèi)的LTB的量也增加；GM130+GM 組5、15、30 min細胞內(nèi)均無紅色熒光信號，表明神經(jīng)節(jié)苷脂(GM)能夠阻斷LTB進入巨噬細胞內(nèi)(Fig 5)。

Fig 4 Map of protein-protein interaction

Fig 5 The immunofluorescence analysis of interactions between LTB fusion protein and Vim or GM130

A:Vim 5 min;B:Vim 15 min;C:Vim 30 min;D:GM130 5 min;E:GM130 15 min;F:GM130 30 min;G:GM130+GM 5 min;H:GM130+GM 15 min;I:GM130+GM 30 min

2.5 相互作用蛋白β-actin和Hspd1表達水平檢測 LTB處理 RAW 264.7細胞12 h后，與對照組相比，β-actin的表達是上調(diào)的，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Hspd1表達無變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Fig 6, Fig 7)。

Fig 6 Expression of β-actin and Hspd1 in RAW 264.7 induced by LTB

Fig 7 Analysis for volume of interacting proteins of LTB

*P<0.05vsNaCl

3 討論

大腸桿菌不耐熱腸毒素 B 亞單位(LTB)是一種非常有效的黏膜免疫佐劑，它能刺激機體產(chǎn)生強烈的黏膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答。大量研究表明LTB與GM1的結(jié)合對于LT的佐劑活性是必需的[14]，并且GM1 是廣泛表達于絕大多數(shù)細胞表面[15-16]，這使得LTB 的佐劑活性的應(yīng)用范圍極廣。還有研究表明LT不但能與神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合，還能與缺乏唾液酸的GM1、GD1b以及乳糖神經(jīng)酰胺等受體結(jié)合，然而，這些受體對于LTB的佐劑活性的作用尚不清楚[17]。還有研究表明LTB在某些反應(yīng)中表現(xiàn)出比LT和CT更好的黏膜佐劑效應(yīng)[18-20]，且LTB幾乎沒有毒性。LTB通過與細胞表面的GM1結(jié)合，不僅能增強機體對抗原的免疫應(yīng)答效應(yīng)，還能夠改變黏膜免疫應(yīng)答的類型。一些研究表明LTB并不能促進DC細胞的成熟[9]。LTB對于T細胞的作用也不全是促進作用，LTB除能促進CD4+T細胞的增殖外，還能誘導(dǎo)CD8+T細胞的凋亡[6,8]。因此對于LTB佐劑的活性機制的研究就顯得十分必要。為此，本文通過pull-down實驗結(jié)合質(zhì)譜，鑒定了與LTB存在相互作用的25種蛋白分子，通過對這些蛋白分子的功能和信號通路查詢，發(fā)現(xiàn)有4種蛋白未顯示出與其他蛋白的相互作用，也未發(fā)現(xiàn)與之相關(guān)信號通路；11種Keratin家族蛋白主要構(gòu)成細胞骨架，維持細胞形態(tài)功能的穩(wěn)定，也沒有找到它們與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的證據(jù)；余下的10種蛋白分子中Pkp1、Anxa2、Hspd1、Ddx5都沒有與之相關(guān)的信號通路，除Ddx5能夠調(diào)節(jié)Th17細胞的功能同時能促進細胞的增殖外，未見到他們參與免疫調(diào)節(jié)的報道，Actb參與白細胞的跨內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)移，它在上皮細胞的表達上調(diào)能夠影響細胞骨架蛋白的重排，從而促進白細胞由血液透過上皮細胞向組織細胞的轉(zhuǎn)移，但在巨噬細胞中表達增加作用尚不清楚；Vimentin參與人類皰疹病毒第四型的感染的信號通路，但通過免疫熒光實驗表明LTB在細胞內(nèi)與Vimentin不存在相互作用；Dsp能夠通過與Jup作用激活TCF/LEF，達到促進cyclin1、c-Myc和PPARy基因的表達從而促進細胞的增殖與活化，研究表明TCF/LEF能夠通過影響B(tài)cl-2、IL-6、ICOS影響TFH細胞的活動，從而促進T細胞和B細胞的增殖與分化，以及影響IL-4, IL-21等細胞因子和免疫球蛋白的表達[21-23]。免疫熒光阻斷實驗驗證了LTB內(nèi)吞進入巨噬細胞內(nèi)必須依賴于與細胞表面的GM1受體結(jié)合，內(nèi)吞進入細胞內(nèi)通過與GM130的結(jié)合，由高爾基體進行加工轉(zhuǎn)運，LTB本身也是一種抗原，免疫細胞對其加工處理很可能與其他一般抗原加工處理途徑是一致的。再與Jup等作用激活TCF/LEF從而引起一系列免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，因此推測LTB發(fā)揮佐劑活性的信號通路(Fig 8)。

Fig 8 T and B cell differentiation and proliferation: Immunoglobulin and cytokine secretion

LTB作為佐劑的研究由來已久，LTB已被認為是最有潛力的黏膜免疫佐劑，本研究通過蛋白質(zhì)相互作用與生物信息學(xué)預(yù)測，推測了LTB發(fā)揮佐劑活性可能的信號通路，為LTB的進一步深入研究和臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

(致謝：本實驗完成于重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心，在此感謝本實驗室的老師及實驗管理人員，同時也感謝我的指導(dǎo)老師馬永平教授在實驗過程的指導(dǎo)及幫助。)

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Exploration for interacting protein ofE.coliat-labile enterotoxin B subunit(LTB) as adjuvant

LIU Lin，ZHOU Hui-cong，WANG Qiu-juan，CHEN Si-jing，MA Yong-ping

(DeptofBiochemistryandMolecularBiology，MolecularMedicineandTumorResearchCenter,ChongqingMedicalUniversty，Chongqing400016，China)

Aim To explore the mechanism ofE.coliheat-labile enterotoxin B subunit(LTB) as adjuvant by analysis of cellular proteins interacting with LTB.Methods Whole cell proteins were purified from RAW 264.7 cell after treated with LTB or NaCl 12 h, respectively. The cellular proteins were interacted with LTB and the interacting proteins were purified by pull-down assay and identified by mass spectrography. The LTB interaction proteins were conformed with Western blot and immunofluorescence assay.Results 25 LTB interaction proteins were found, and their interaction network was mapped; four proteins(Jup, Dsp, Ddx5 and Vimentin) were indicated to be related with LTB adjuvant activity; immunofluorescence assay indicated that GM130 interacted with LTB, however, Vimentin had no interaction with LTBinvivo. After treated by LTB, the expression of β-actin was upregulated obviously in RAW 264.7 cell, whereras, Hspd1 did not show any change.Conclusions LTB exerts adjuvant activity through binding to GM1 of immune cells, causing endocytosis and transporting to the Golgi apparatus by vesicles. Then LTB might bind to Jup and affect TCF/LEF activity, regulating the expression of Bcl 2, IL-6, and Runx3. The result is promoted T cell and B cell proliferation, differentiation and activation by secretion of cytokines and immunoglobulins.

LTB; RAW 264.7; interacting protein; immune; adjuvant; endocytosis

時間：2016-12-5 15:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.048.html

2016-06-30,

2016-08-20

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 30972585)

劉 林(1990-)，男,碩士,研究方向：腫瘤與基因工程疫苗，E-mail：1137997269@qq.com; 馬永平(1968-)，男,博士,碩士生導(dǎo)師,研究方向：腫瘤與基因工程疫苗，通訊作者，E-mail：ypmaqq@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.024

A

1001-1978(2016)12-1761-06

R329.24；R341 ；R392.11；R392.12；R378.21；R977.6