余建洪，曾章銳，劉 戀，張開炯，李寶林，劉靳波

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，四川 瀘州646000)

頭孢吡肟敏感性低于頭孢他啶陰溝腸桿菌的耐藥基因研究

余建洪，曾章銳，劉 戀，張開炯，李寶林，劉靳波*

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，四川 瀘州646000)

目的 研究臨床分離的陰溝腸桿菌對(duì)頭孢吡肟(FEP)敏感性低于頭孢他啶(CAZ)的耐藥基因，為醫(yī)院感染控制提供參考。方法 收集臨床分離的經(jīng)瓊脂稀釋法證實(shí)的頭孢吡肟(PEP)敏感性低于CAZ的陰溝腸桿菌菌株8株，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增細(xì)菌耐藥基因。耐藥基因水平傳播采用質(zhì)粒接合試驗(yàn)。結(jié)果 8株菌株中有3株耐藥基因OXA-1和OXA-31同時(shí)陽(yáng)性，2株耐藥基因OXA-10和OXA-35同時(shí)陽(yáng)性，且以上基因在菌株質(zhì)粒中均擴(kuò)增陽(yáng)性，但僅2株接合成功，而耐藥基因PSE-1全部陰性。結(jié)論 耐藥基因OXA1、OXA10、OXA31和OXA35是導(dǎo)致陰溝腸桿菌對(duì)頭孢吡肟敏感性低于頭孢他啶的重要機(jī)制之一，有通過(guò)質(zhì)粒介導(dǎo)進(jìn)行傳播的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)采取措施防止其爆發(fā)流行。

陰溝腸桿菌；頭孢吡肟；頭孢他啶；耐藥機(jī)制；聚合酶鏈反應(yīng)

(ChinJLabDiagn,2016,20:2058)

陰溝腸桿菌是存在于人和動(dòng)物腸道內(nèi)的正常菌群，為條件致病菌。由于廣譜抗菌藥物的大量使用以及患者免疫功能低下等原因，陰溝腸桿菌已成為醫(yī)院感染中非常重要的病原菌之一[1]。由于頭孢吡肟的大量使用，臨床分離出頭孢吡肟敏感性低于頭孢他啶的銅綠假單胞菌[2,3]，且與OXA-1、OXA-10、OXA-31、OXA-35或PSE-1等耐藥基因有關(guān)[4]。本文對(duì)陰溝腸桿菌頭孢吡肟敏感性低于頭孢他啶的的相關(guān)耐藥基因進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 收集2013年9月—2015年9月經(jīng)MicroScan WalkAway 96Plus全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏測(cè)試系統(tǒng)檢測(cè)和瓊脂稀釋法證實(shí)的FEP的MIC高于CAZ的MIC的8株陰溝腸桿菌，剔除同一患者相同部位重復(fù)菌株。試驗(yàn)操作及菌株MIC判斷參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)(2015版)標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌(ATCC 25922)及銅綠假單胞菌(ATCC 27853)。利福平耐藥的大腸埃希菌EC600為接合試驗(yàn)用。

1.2 試劑與材料 FEP和CAZ干粉為中美上海施貴寶制藥有限公司產(chǎn)品，MH瓊脂干粉為杭州天和產(chǎn)品，LB培養(yǎng)基為Oxoid公司產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒為百泰克公司產(chǎn)品，PCR引物、Buffer、dNTPs、Taq DNA酶和MgCL2為TaKaRa公司產(chǎn)品，DNA Marker DL2000為大連寶生公司產(chǎn)品，瓊脂糖為Oxoid公司產(chǎn)品。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 細(xì)菌總DNA耐藥基因擴(kuò)增 煮沸法提取細(xì)菌總DNA作為模板，通過(guò)降落PCR擴(kuò)增耐藥基因OXA-1、OXA-10、OXA-31、OXA-35和PSE-1，引物見表1。反應(yīng)體系( 50 μl)：TaKaRa Ex Taq(5 U/μl)0.25 μl， 10×Ex Taq Buffer(Mg2+free)5 μl，MgCl2(25 mM)4 μl，dNTP Mixture(各2.5 mM)4 μl，模板2 μl，上游引物(10 μM)1 μl，下游引物(10 μl)1 μl，加0.1%RNA酶的滅菌蒸餾水至50 μl。反應(yīng)參數(shù)[5]，見圖1。反應(yīng)結(jié)束后取6 μl產(chǎn)物在15 g/L瓊脂糖中進(jìn)行電泳分析。

表1 本研究所用的PCR引物

圖1 本研究所用PCR反應(yīng)參數(shù)

1.4 耐藥酶基因水平傳播分析

1.4.1 質(zhì)粒耐藥基因 根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書，對(duì)耐藥基因陽(yáng)性菌株提取質(zhì)粒DNA作為反應(yīng)模板，對(duì)相應(yīng)的耐藥基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.4.2 接合試驗(yàn) 對(duì)質(zhì)粒DNA耐藥基因擴(kuò)增陽(yáng)性菌株進(jìn)行接合試驗(yàn)。方法同文獻(xiàn)報(bào)道[6]。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌總DNA耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果

8株菌株中有3株(2、4、7號(hào)菌株)耐藥基因OXA-1和OXA-31同時(shí)陽(yáng)性，2株(5號(hào)、8號(hào)菌株)耐藥基因OXA-10、OXA-35同時(shí)陽(yáng)性，耐藥基因PSE-1全部陰性。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖見圖2-5。

圖2 OXA-1擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖 圖3 OXA-31擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖4 OXA-10基因擴(kuò)增電泳圖 圖5 OXA-35基因擴(kuò)增電泳圖

備注：圖2-5中1-8分別為1-8號(hào)菌株，N為陰性對(duì)照，M為DNA Marker(DL2000)

2.2 質(zhì)粒DNA耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果

細(xì)菌總DNA耐藥基因陽(yáng)性菌株的質(zhì)粒DNA相應(yīng)基因擴(kuò)增均為陽(yáng)性，即2號(hào)、4號(hào)、7號(hào)菌株質(zhì)粒DNA耐藥基因OXA-1和OXA-31同時(shí)陽(yáng)性，而5號(hào)、8號(hào)菌株質(zhì)粒DNA耐藥基因OXA-10和OXA-35同時(shí)陽(yáng)性。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖見圖6。

圖6 細(xì)菌質(zhì)粒DNA耐藥基因擴(kuò)增電泳圖

備注：1-3分別為2號(hào)、4號(hào)、7號(hào)菌株blaOXA-1，4、5分別為5號(hào)、8號(hào)菌株blaOXA-10，6-8為分別為2號(hào)、4號(hào)、7號(hào)菌株blaOXA-31，9、10分別為5號(hào)、8號(hào)菌株blaOXA-35，N為陰性對(duì)照，M為DNA Maker(DL2000)

2.3 接合試驗(yàn)

2號(hào)和5號(hào)菌株質(zhì)粒接合試驗(yàn)成功，經(jīng)MicroScan WalkAway 96 Plus全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏測(cè)試系統(tǒng)鑒定為大腸埃希菌，分別擴(kuò)增出OXA-1、OA-31和OXA-10、OXA-35。

3 討論

腸桿菌科細(xì)菌是醫(yī)院獲得性感染的重要細(xì)菌之一，占所有分離菌株的45.3%，而腸桿菌屬臨床分離率在腸桿菌科細(xì)菌中排名第三位，僅次于大腸埃希菌和克雷伯菌屬[7]。而陰溝腸桿菌是腸桿菌屬的典型代表，隨著第4代頭孢菌素的使用，頭孢吡肟耐藥率逐年增加，敏感性明顯下降[8，9]。陰溝腸桿菌的耐藥機(jī)制主要有耐藥酶的產(chǎn)生、外排系統(tǒng)的過(guò)度表達(dá)以及質(zhì)粒攜帶多藥耐藥整合子基因[10-12]。

本文對(duì)8株頭孢吡肟敏感性低于頭孢他啶陰溝腸桿菌的耐藥基因OXA-1、OXA-10、OXA-31、OXA-35和PSE-1進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示：有5株擴(kuò)增陽(yáng)性，其中2號(hào)、4號(hào)和7號(hào)菌株耐藥基因OXA-11和OXA-31同時(shí)陽(yáng)性，與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致，OXA-1基因的表達(dá)能使陰溝腸桿菌頭孢吡肟或頭孢匹羅的MIC升高，而對(duì)頭孢他啶沒有影響，尤其是當(dāng)孔蛋白OMP鈍化或表達(dá)降低時(shí)，這種效應(yīng)更明顯。其機(jī)制[14]可能為OXA-1能選擇性地水解一些具有2-氨基-5噻唑基結(jié)構(gòu)的頭孢菌素類，如頭孢吡肟、頭孢匹羅，而對(duì)其他類型的頭孢菌素沒有水解作用，如頭孢他啶。并且耐藥基因OXA-1和OXA-31對(duì)以上特殊耐藥表型的影響具有協(xié)同作用[15]。而5號(hào)和8號(hào)菌株耐藥基因OXA-10和OXA-35同時(shí)陽(yáng)性，原因[16]可能為OXA-35是一種OXA-10相關(guān)的β內(nèi)酰胺酶，兩者均可以使頭孢吡肟敏感性降低，而對(duì)頭孢他啶無(wú)明顯影響。由于具有以上特殊耐藥表型的菌株數(shù)量較少，PSE-1擴(kuò)增結(jié)果全部為陰性。5株耐藥基因陽(yáng)性菌株質(zhì)粒DNA相應(yīng)基因全為陽(yáng)性，其中有2株接合成功，可能與菌株攜帶耐藥基因的整合子有關(guān)[17]。

頭孢吡肟敏感性低于頭孢他啶的陰溝腸桿菌耐藥基因可通過(guò)質(zhì)粒介導(dǎo)傳播，應(yīng)引起臨床醫(yī)師和感染控制人員的高度警惕，應(yīng)采取措施防止其爆發(fā)流行。

[1]胡付品，朱德妹，汪 復(fù)，等.2013年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J].中國(guó)感染與化療雜志，2014，14(5)：365.

[2]曾章銳，王衛(wèi)萍，黃 梅，等.臨床分離的銅綠假單胞菌對(duì)頭孢吡肟敏感性低于頭孢他啶的機(jī)制研究[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2014,29(11)：1178.

[3]Campo Esquisabel AB,Rodríguez MC,Campo-Sosa AO,et al.Mechanisms of resistance in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa less susceptible to cefepime than to ceftazidime[J].ion,2011,17(12):1817.

[4]Pena C,Suarez C,Tubau F,et al.Nosocomial Outbreak of a Non-Ce-Fepime-Susceptible Ceftazidime-Susceptible Pseudomonas aeruginosa strain overexpressing MexXY-OprM and producing an integron-borne PSE-1 β-lactamase[J].J Clin Microbiol,2009,47(8):2381.

[5]萬(wàn) 兵，閆 杰，季明春，等.一種優(yōu)化的PCR方法——降落PCR擴(kuò)增目的基因[J].江蘇臨床醫(yī)學(xué)雜志，2002,6(2)：127.

[6]田鵬鵬，朱麗莎，艾 彪，等.1株陰溝腸桿菌臨床分離株對(duì)亞胺培南耐藥機(jī)制的研究[J].重慶醫(yī)學(xué)，2016，45(7)：970.

[7]胡付品，朱德妹，汪 復(fù)，等.2014年CHINET中國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J].中國(guó)感染與化療雜志，2015,15(5)：401.

[8]周 祥，惠紅巖，金保哲，等.NSICU患者陰溝腸桿菌感染分布與耐藥性分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2015,25(10)：4583.

[9]劉鵬飛，陳佑明，孫恒彪，等.陰溝腸桿菌耐藥性分析及NDM-1基因檢測(cè)[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2014,24(21)：5204.

[10]王鳳霞.陰溝腸桿菌的耐藥性分析及其耐藥機(jī)制研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2013，23(21)：5128.

[11]溫見翔，陳 娟，楊 虹.陰溝腸桿菌AcrAB-TolC外排系統(tǒng)基因研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2014,18(7)：1058.

[12]Hornsey M,Ellington MJ,Doumith M,et al.Emergence of AcrAB-mediated tigecycline resisitance in a clinical isolate of Enterobacter cloacae during ciprofloxacin treatment[J].Int J Antimicrob Agents,2010,35(5):478.

[13]Alejandro Beceiro,Sunil Maharjan,Tom Gaulton,et al.False extended-spectrum β-lactamase phenotype in clinical isolates of Escherichia coli associated with increased expression of OXA-1 or TEM-1 penicillinases and loss of porins[J].J Antimicrob Chemother,2011,66:2006.

[14]Aubert D,Poirel L,Chevalier J,et al.Oxacillinase-Mediated Resistance to Cefepime and Susceptibility to Ceftazidime in Pseudomonas aeruginosa[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2001,45(6):1615.

[15]Aubert D,Pairel L,Chevalier,et al.Oxacillinase-mediated resisitance to cefepime and susceptibility to ceftazidime in Pseudomonas aeruginosa[J].Antimicrob Agents Chemother,2001,45:1615-1620.

[16]Daniel Aubert,Laurent Poirel,Adel Ben Ali,et al.OXA-35 is an OXA-10-related β-lactamase from Pseudomonas aeruginosa[J].2001,48:717.

[17]李 巖，蘇建榮，許淑珍,等.陰溝腸桿菌的I類整合子檢測(cè)及相關(guān)耐藥基因分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2010,14(9)：1356.

Study resistant genes of less susceptibility to cefepime than to ceftazidime in clinical isolates of Enterobacter cloacae

YUJian-hong,ZENGZhang-rui,LIULian，etal.

(DepartmentofClinicalLaboratory,TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

Objective Study resistant genes of less susceptibility to cefepime(FEP) than to ceftazidme(CAZ) in clinical isolates of Enterobacter cloacae,so as to provide references for controlling the hospital infection.Methods A total of eight isolates of Enterobacter cloacae which had been confirmed being less susceptible to FEP than to CAZ for minimal inhibitory concentration(MIC) by agar dilution method were collected.The resistance genes were amplified by polymerase chain reaction(PCR).Horizontal transmission of the resistance genes were tested by Plasmid conjugation test.Results The resistance gene amplification results showed:OXA-1 and OXA-31 were positive in three strain simultaneously,OXA-10 and OXA-35 were positive in two strain Simultaneously,but PSE-1 was not amplified in all eight isolates.The resistance genes in plasmid DNA of five all positive genomic strains were amplified ,but only two of the five strains were successfully joined.Conclusion The resistance gene of OXA-1,OXA-10,OXA-31 or OXA-35 was an important mechanism,that resulted in Enterobacter cloacae less suscepitibiltiy to PEF than to CAZ,and has transmission risk mediated by plasmid.Measures should be taken to prevent the outbreak.

Enterobacter cloacae;Cefepime;Ceftazidme;Resistance mechanism;Polymerase chain reaction

四川大學(xué)與瀘州市人民政府戰(zhàn)略合作項(xiàng)目，2013CDLZ-S15

1007-4287(2016)12-2058-04

R378.2

A

余建洪，男，主管檢驗(yàn)師、臨床執(zhí)業(yè)醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，研究方向：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)。

2016-04-28)

*通訊作者