馬 延，郭金耀，劉 雷，范 春

（河北省任丘市華北石油管理總醫(yī)院，河北 任丘 062552）

GM1體外誘導(dǎo)人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞研究

馬 延，郭金耀，劉 雷，范 春

（河北省任丘市華北石油管理總醫(yī)院，河北 任丘 062552）

目的研究單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂通過體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞并探索其最佳誘導(dǎo)濃度。方法取足月妊娠剖宮產(chǎn)健康胎兒的臍帶，剔除臍動(dòng)脈和臍靜脈，用酶消化法獲得 MSCs，貼壁培養(yǎng)，采用流式細(xì)胞技術(shù)行細(xì)胞表型檢測(cè)。擴(kuò)增后，取第4代細(xì)胞，分為 A、B、C、D、E 5組，前4組為實(shí)驗(yàn)組，E組為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組各組 GM1濃度分別為：A組50μg／mL、B組100μg／mL、C組150μg／mL、D組200μg／mL，誘導(dǎo)液用L-DMEM培養(yǎng)基配制，對(duì)照組僅使用L-DMEM培養(yǎng)基。觀察5組誘導(dǎo)人臍帶血間質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的作用，每 60min觀察細(xì)胞誘導(dǎo)前后的形態(tài)，在第360min時(shí)采用免疫細(xì)胞染色法檢測(cè)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、神經(jīng)絲蛋白（neurofilaments protein H，NF-H）以及神經(jīng)元特異性標(biāo)記物微管結(jié)合蛋白-2（microtubule associated protein 2，MAP-2）的表達(dá)情況，并計(jì)算陽性細(xì)胞率。結(jié)果①大部分原代細(xì)胞在接種9h后貼壁，呈多邊形、菱形，之后變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，細(xì)胞開始以漩渦、放射狀生長(zhǎng)。②P3、P5和 P10代細(xì)胞表面的分子標(biāo)記經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，均表達(dá) CD105、CD90和 CD73，卻不表達(dá)HLA-DR、CD19、CD11b、CD45以及 CD34。③誘導(dǎo)至第360分鐘后，實(shí)驗(yàn)組各組細(xì)胞均有神經(jīng)樣細(xì)胞出現(xiàn)，表現(xiàn)為細(xì)胞胞體收縮成橢圓形，伸出較長(zhǎng)突起，以雙極細(xì)胞居多。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組各組NF-H、MAP-2表達(dá)陽性，膠質(zhì)纖維酸性蛋白GFAP表達(dá)為陰性，C組（150μg／mL）細(xì)胞 NF-H、MAP-2陽性表達(dá)率最高。對(duì)照組細(xì)胞誘導(dǎo)前后變化不明顯。結(jié)論GM1可以誘人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化，150μg／mL為最合適誘導(dǎo)劑量。

單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂； 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞； 誘導(dǎo)分化； 神經(jīng)樣細(xì)胞

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）作為一種可以自我復(fù)制通過具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，這種干細(xì)胞能夠發(fā)育成硬骨、軟骨、脂肪和其他類型的細(xì)胞。Baksh等［1］目前已經(jīng)從臍帶靜脈中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞，同時(shí)發(fā)現(xiàn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）具有很好的增殖及分化能力，其取材過程不具有侵襲性以及倫理學(xué)限制，因此被認(rèn)為科研以及臨床研究中的間充質(zhì)干細(xì)胞來源。神經(jīng)節(jié)苷脂（ganglioside，GS）是一類含唾液酸的糖鞘脂，廣泛存在于脊椎動(dòng)物各組織細(xì)胞膜上，以大腦灰質(zhì)中含量最高，其與神經(jīng)細(xì)胞的分化、神經(jīng)樹突的伸長(zhǎng)、突觸的形成有重要關(guān)系［2］。較早的研究就已發(fā)現(xiàn)外源性施加神經(jīng)節(jié)苷脂可以促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的再生和突觸的形成。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了GM1體外誘導(dǎo) HUMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的研究，并對(duì) HUMSCs的神經(jīng)分化機(jī)制進(jìn)行了探討。

材料和方法

1 臍帶來源

取足月妊娠剖宮產(chǎn)健康的新生兒臍帶，華北石油管理總醫(yī)院婦產(chǎn)科提供。

2 主要試劑

單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液，低糖及高糖DMEM／F-12培養(yǎng)基，胎牛血清，胰蛋白酶，青、鏈霉素霉素溶液（上海拜力生物），DMSO（美國賽默飛世爾科技公司），Triton-X 100（上海索萊寶生物科技有限公司），多聚甲醛（天津市化學(xué)制劑研究所），表皮生長(zhǎng)因子，F(xiàn)ITC-CD19抗體，F(xiàn)ITC-CD34抗體，PE-CD11b抗體，PE-CD73抗體，PE-CD45抗體，PECD105抗體，PE-CD90抗體，GFAP抗體（BD公司），NF-H抗體（Cell Signaling Technology公司），MAP-2抗體（Millipore公司），PS免疫組化試劑盒（北京中杉金橋公司）。

3 HUMSCs的體外分離與擴(kuò)增

收集足月健康胎兒的臍帶，用磷酸緩沖鹽溶液進(jìn)行沖洗，去除臍靜脈以及動(dòng)脈，然后把切割余下臍帶間質(zhì)組織成1mm3小塊，膠原酶Ⅱ（0.2%）進(jìn)行消化，最后放于DMEM／F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)（2ng／mL表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、20%胎牛血清、25mM左旋谷氨酰胺、100μg／mL鏈霉素以及100U／mL青霉素）。待細(xì)胞至90%以上融合后棄去培養(yǎng)基，磷酸緩沖鹽洗滌，加胰酶EDTA消化液2mL，37℃消化3min，吹打細(xì)胞到完全脫落，離心上清后用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，吹打均勻，按照1∶2的比例傳代。在5%CO2、37℃培養(yǎng)，24h后換液，將未貼壁細(xì)胞除去，以后每48～72h換液，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀況。

4 HUMSCs的細(xì)胞表型分析

用一對(duì)成長(zhǎng)期的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，采用0.25%胰蛋白酶以及0.2g／L的EDTA混合液進(jìn)行消化，接下來采用PBS沖洗懸浮成單細(xì)胞懸液后用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，分別裝于10只1.5mL的EP管中，每管大于106個(gè)細(xì)胞，之后分別加5μL的鼠抗人單克隆抗體CD45-PE、CD11-PE、CD90-PE、CD73-PE、CD105-PE、CD19-FITC、CD34-FITC以及 HLADR-PE，剩余兩個(gè) EP管分別加入7μL抗鼠 IgG1-FITC以及 IgG1-PE為對(duì)照組，4℃避光孵育 30s；加入少量 PBS沖洗、離心、去上清，重懸細(xì)胞后，采用BD公司 LSRFortessa型號(hào)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

5 GM1誘導(dǎo)HUMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化

按照隨機(jī)數(shù)表法將細(xì)胞分為對(duì)照組和觀察組。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好且處于 對(duì)數(shù)生 長(zhǎng)期的 P3代HUMSCs，PBS清洗2次后消化，采用 FBS終止消化離心，最后加 1mL培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞按 1× 105／mL濃度分別加入多聚賴氨酸包被的5個(gè)六孔板中，隨機(jī)分為A、B、C、D、E共5組，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待各組細(xì)胞融合至80%時(shí)，A、B、C、D各組分別加入 GM1濃度為 50μg／mL、100μg／mL、150μg／mL、200μg／mL的誘導(dǎo)液，E組只加入等量 L-DMEM培養(yǎng)基，各組均置于37℃、5%二氧化碳、飽和濕度條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)6h。每1h用倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化1次。

6 誘導(dǎo)細(xì)胞的鑒定

于誘導(dǎo)后第6h，用免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法檢測(cè)各組MAP-2、NF-H、GFAP的表達(dá)情況，具體方法如下：除去六孔板中的培養(yǎng)液，PBS輕洗一次；4%多聚甲醛室溫固定20秒；PBS洗滌三次；用含0.5%Triton-X 100的 PBS室溫避光破膜 15秒；PBS洗滌三次；加入含3%H2O2的去離子水孵育 5秒；PBS沖洗三次；加入封閉血清工作液，孵育 15秒，倒去，不用洗；按照MAP-2與GFAP（1∶200）、NF-H（1∶200）添加稀釋一抗，4℃過一夜；PBS洗滌三次；添加生物素化的二抗工作液，室溫孵育 15 min；PBS洗滌三次；滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫下孵育15秒；PBS洗滌三次；新鮮配制的 DAB顯色1秒；蘇木素進(jìn)行復(fù)染，自來水反復(fù)沖洗。拍照時(shí)棄去六孔板中的培養(yǎng)液，PBS輕洗一次；4%多聚甲醛室溫固定20秒；PBS洗滌三次；用含 0.5%Triton-X 100的 PBS室溫避光破膜15秒；PBS洗滌三次；用含2%小牛血清白蛋白的PBS室溫封閉 1h，倒去，不用洗；按MAP-2與GFAP（1∶200）比例、NF-H（1∶200）稀釋壹抗，4℃過一夜；PBS洗滌三次；鋁箔包裹后在 37℃用二抗孵育0.5h以上；吸除二抗，加入 DAPI染色液室溫作用 15秒以上；PBS洗滌三次；熒光顯微鏡下觀察，用合適波段激發(fā)，照相保存結(jié)果。

7 主要觀察指標(biāo)

①觀察HUMSCs形態(tài)以及生長(zhǎng)情況。②觀察HUMSCs表面的標(biāo)志物表達(dá)情況。③觀察細(xì)胞誘導(dǎo)分化后的特異性標(biāo)志物表達(dá)情況。

8 神經(jīng)樣細(xì)胞特異性標(biāo)記物的統(tǒng)計(jì)

顯微鏡下各組隨機(jī)取12個(gè)非重疊視野，計(jì)算神經(jīng)樣細(xì)胞數(shù)，采用社會(huì)科學(xué)統(tǒng)計(jì)程序 19.0版，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示。

結(jié) 果

1 各組中神經(jīng)樣細(xì)胞的形態(tài)及數(shù)量變化

按1∶1將神經(jīng)細(xì)胞傳代，1d后多數(shù)細(xì)胞已經(jīng)貼壁，呈三角或菱形，2d后細(xì)胞開始增多并呈長(zhǎng)梭形，7d后80%細(xì)胞開始融合，細(xì)胞按照漩渦或放射狀排列。誘導(dǎo)后1h，各組均可見部分細(xì)胞胞體收縮為橢圓狀，兩端伸出突起，呈紡錘樣，以D組神經(jīng)樣細(xì)胞數(shù)量最多，A組最少；第2、3h各組神經(jīng)樣細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，突起伸長(zhǎng)，以 D組比率最高；第4h時(shí)，A、B、C組神經(jīng)樣細(xì)胞數(shù)繼續(xù)增加，表現(xiàn)為雙極或多極細(xì)胞，以雙極細(xì)胞為主，D組神經(jīng)樣細(xì)胞開始脫落，比率不再增加；第 5h時(shí)，A、B組神經(jīng)樣細(xì)胞增加不明顯，可見部分細(xì)胞脫落，C組神經(jīng)樣細(xì)胞數(shù)目最多，也伴隨少量細(xì)胞脫落，D組神經(jīng)樣細(xì)胞呈片狀脫落，比率明顯下降；第 6h時(shí)，A、B組神經(jīng)樣細(xì)胞不再增加，C組神經(jīng)樣細(xì)胞未見明顯變化，D組只有少量沒有脫落的神經(jīng)樣細(xì)胞；E組細(xì)胞誘導(dǎo)前后的形態(tài)并未發(fā)生明顯變化。圖 1為觀察到的雙極細(xì)胞。

2 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物

選擇 P2、P5以及 P10代的細(xì)胞利用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞表面分子標(biāo)志物檢測(cè)，結(jié)果顯示細(xì)胞均表達(dá)CD73、CD90以及CD105，同時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞不表達(dá)CD11b、CD19、CD34、CD45以及HLA-DR（MHC-II）。經(jīng)6 h不同濃度的 GM1誘導(dǎo)后，多數(shù)神經(jīng)樣細(xì)胞的NF-H、MAP-2出現(xiàn)黃綠色熒光，為陽性，GFAP為陰性；而對(duì)照組并未出現(xiàn)陽性表達(dá)，且 PBS組也為陰性。其中箭頭所指的細(xì)胞即為神經(jīng)樣細(xì)胞，多為雙極細(xì)胞。A、B、C、D組細(xì)胞中表達(dá)的 NF-H及MAP-2均高于 E組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且C組神經(jīng)樣細(xì)胞抗原表達(dá)率最高。表1為根據(jù)熒光顯微鏡觀察后所統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)。

表1 不同質(zhì)量濃度 GM1誘導(dǎo)液誘導(dǎo) HUMSCs 6h后神經(jīng)樣細(xì)胞抗原表達(dá)率的比較

討 論

MSCs通常是中胚層的成體干細(xì)胞中起源，并從骨髓、胎盤以及臍帶血等組織中分離而來，具有高度增殖、自我更新以及多向分化的潛力。研究發(fā)現(xiàn)HUMSCs比 MSCs優(yōu)勢(shì)有以下幾點(diǎn)：1、臍帶的來源并不受限于倫理學(xué)，且成本低；2、HUMSCs具有抑癌性不會(huì)導(dǎo)致畸胎瘤發(fā)生，此外HUMSCs還具有低免疫原性，免疫調(diào)節(jié)穩(wěn)定性等，因此具有良好的臨床治療潛力［3］。目前大多數(shù)報(bào)道發(fā)現(xiàn) MSCs移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病效果令人滿意［4-5］。然而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MSCs移植到損傷神經(jīng)組織后，僅少量分化成神經(jīng)樣細(xì)胞［6-7］；體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)證實(shí)損傷的脊髓組織液僅能低效的誘導(dǎo) BMSCs分化成神經(jīng)樣細(xì)胞［8-9］。因此，尋找能誘導(dǎo)或促 MSCs分化的藥物具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了神經(jīng)節(jié)苷脂可以在體外誘導(dǎo) HUMSCs分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，并表達(dá)神經(jīng)元特異性蛋白：微管結(jié)合蛋白-2、NF-H，但并不表達(dá)GFAP。

GS是由親水的單唾液酸的寡糖鏈以及疏水的神經(jīng)酰胺組成含有單唾液酸的鞘糖脂，研究發(fā)現(xiàn)其影響細(xì)胞粘附、識(shí)別以及的跨膜信息傳導(dǎo)，其機(jī)制主要利用多肽生長(zhǎng)因子來促進(jìn)細(xì)胞增殖以及成熟。外源性的神經(jīng)節(jié)苷脂通過血腦屏障后促進(jìn)神經(jīng)元軸索再生形成突觸［10］，從而提高神經(jīng)營養(yǎng)因子對(duì)細(xì)胞的作用［11］，抑制損傷的神經(jīng)細(xì)胞凋亡［12］，保持神經(jīng)干細(xì)胞的快速增長(zhǎng)［13］。

趙春華等［14］發(fā)現(xiàn)，亞全能干細(xì)胞群的亞全能基因組除了原始干細(xì)胞表型丟失外，其在胚胎發(fā)育成熟后仍然具有干細(xì)胞的作用。在適宜的環(huán)境刺激下，細(xì)胞可以進(jìn)一步分化為各種組織細(xì)胞。HUMSCs在 GM1誘導(dǎo)下可以激活神經(jīng)細(xì)胞特異性的表達(dá)，促使HUMSCs分化成神經(jīng)細(xì)胞，其激活的機(jī)制可能為：①對(duì) HUMSCs的跨膜離子流產(chǎn)生影響，Ca2＋作為細(xì)胞內(nèi)信息傳遞的第二信使，其在細(xì)胞內(nèi)外的濃度變化以及跨膜流動(dòng)受到 Ca2＋-ATP酶的調(diào)節(jié)并可引起不同生物學(xué)效應(yīng)。崔文［15］等人的研究表明，外源性的 GM3對(duì) Ca2＋-ATP酶有雙向調(diào)節(jié)作用，即低濃度抑制，高濃度激活。劉云云［16］等人發(fā)現(xiàn)，Ca2＋螯合劑川芎嗪可以抑制胞內(nèi)Ca2＋信號(hào)，增加NSE和Nurrl基因的表達(dá)，最終促使 HUMSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞。由此可以推斷 150μg／mL GM1誘導(dǎo)液是否抑制了HUMSCs細(xì)胞膜上的 Ca2＋-ATP酶，從而減少了細(xì)胞內(nèi) Ca2＋的濃度，進(jìn)而影響了跨膜信號(hào)的傳遞，導(dǎo)致一些神經(jīng)元特異基因的表達(dá)，最終促使HUMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化；②對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子的作用，GM1可以促進(jìn) NGF的產(chǎn)生［17］，高濃縮的神經(jīng)營養(yǎng)因子培養(yǎng)液模擬了胚胎發(fā)育階段神經(jīng)發(fā)生的微環(huán)境，在神經(jīng)營養(yǎng)因子作用下，上調(diào) MSC膜蛋白表達(dá)，其中TrkA、TrkB、TkrC和神經(jīng)營養(yǎng)因子受體結(jié)合后可以重拍基因表達(dá)程序［18］，讓 MSC分化為神經(jīng)細(xì)胞。③影響神經(jīng)突出，GM1通過激活細(xì)胞膜表面的異位蛋白激酶，傳遞信號(hào)至胞內(nèi)，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)突起的生長(zhǎng)以及延長(zhǎng)。

目前，神經(jīng)節(jié)苷脂作為一種神經(jīng)營養(yǎng)藥物已經(jīng)廣泛應(yīng)于臨床并發(fā)揮了治療作用，但 GM1能否在體內(nèi)將移植的HUMSCs有效地誘導(dǎo)為神經(jīng)細(xì)胞并發(fā)揮作用還待于進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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（楊 歡 張?jiān)鑫渚庉嫞?/p>

Differentiation of Human Umbilical Cord Blood Mesenchymal Stem Cells into Neuron Like Cells in Vitro Induced by GM1

MA Yan，GUO Jin-yao，LIU Lei，F(xiàn)AN Chun
（General Hospital of Huabei Petroleum Administration，Renqiu 062552，China）

ObjectiveTo study the monosialo four hexose ganglioside（GM1）induced human umbilical cord mesenchymal stem cells into neuron like cells and to explore the optimal concentration in vitro.MethodsThe umbilical cord，umbilical artery and umbilical vein were collected from the healthy fetus in full term pregnancy.The MSCs was obtained by enzyme digestion method and the cell phenotype was determined by flow cytometry.After amplification，the fourth generation cells were divided into A，B，C，D，E five groups.The first 4 groups were the experimental groups，E as control group.The experimental group cells were treated with different concentrations of GM1，group A 50μg／mL，B 100μg／mL group and C group 150μg／mL group D 200μg／mL.Inducing medium was diluted by L-DMEM，the control group was only treated with L-DMEM medium.The morphology of 5 groups was observed and compared every 60 min.At 360 min，the expression of glial fibrillary acidic protein（GFAP）and neurofilament protein（neurofilaments protein H，NF-H）and neuron specific markers of microtubule-associated protein 2（MAP-2）was examined by immunohistochemistry，and calculate the rate of positive cells.ResultsMost of the primary cells were adherent at 9h after inoculation.The cells evolved from polygonal and diamond shapes to spindle shape，and then into spiral and radial shape.Expression of CD105 and CD73，but not HLA-DR，CD90，CD19，CD11b，CD45，CD34，and P3 were detected by flow cytometry.The molecular markers of P5 and P10 on cell surface were detected by flow cytometry.At 360th minutes after induction，the cells of the experimental group were found to be neuron like cells，which showed that the cell bodies were contracted into oval shape，extending out longer processes，and the bipolar cells were the majority.The expression of NF-H and MAP-2 were detected in the experimental group，whereas GFAP was negative.NF-H and MAP-2 in C group（150μg／mL）was at highest rate.Conclusionmonosialo four hexose ganglioside，GM1 can induce umbilical cord mesenchymal stem cells to differentiate into neuron like cells.The concentration of 150μg／mL was the most appropriate induction dose.

Monosialo four hexose ganglioside； Human umbilical cord mesenchymal stem cells；Differentiation； Euron like cells

10.11748／bjmy.issn.1006-1703.2016.12.030

2016-10-27；

2016-11-21