葉 芳,柏 平,曾凡星,石麗君
體育科學
不同強度運動對自發(fā)性高血壓大鼠血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)及功能影響的氧化應激機制
葉 芳,柏 平,曾凡星,石麗君
目的:觀察不同強度運動對自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)腸系膜動脈內(nèi)皮結(jié)構(gòu)及功能的影響,探討氧化應激在其中的作用機制。方法:選用3月齡雄性SHR和正常血壓大鼠(Wistar Kyoto,WKY)隨機分為安靜對照組(SHR-C,WKY-C)、中等強度運動組(SHR-M,WKY-M)和高強度運動組(WKY-H,SHR-H)。中等強度運動組以18~20 m/min、高強度運動組以26~28 m/min進行跑臺運動,坡度為0°,60 min/天,5天/周。8周運動訓練末進行無創(chuàng)尾動脈血壓測試、血清氧化應激指標檢測、內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)透射電鏡觀察及腸系膜動脈微血管張力測定。結(jié)果:1)SHR-M的收縮壓和舒張壓顯著低于SHR-C(P<0.05),而SHR-H顯著高于SHR-C(P<0.05)。2)血清氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)檢測顯示:SHR-C組血清MDA含量與WKY-C相比,均值有升高趨勢但不具有統(tǒng)計學差異(P>0.05),SHR-M組MDA含量與SHR-C不具有顯著性差異(P>0.05),但SHR-H血清MDA含量顯著高于SHR-C(P<0.05);抗氧化物酶谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化物歧化酶(SOD)檢測顯示:SHR-C GSH-Px酶活力顯著低于WKY-C組(P<0.05),SHR-M組和SHR-H組GSH-Px酶活力顯著高于SHR-C(P<0.05)。WKY-M SOD顯著高于WKY-C(P<0.05),SHR運動組與SHR安靜組相比較SOD無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。3)透射電鏡結(jié)果顯示:SHR-C和SHR-H組均表現(xiàn)為內(nèi)皮細胞畸形、膠原纖維增生,而SHR-M血管內(nèi)皮細胞形態(tài)完整。4)微血管張力測定結(jié)果顯示:SHR-C內(nèi)皮依賴性血管舒張能力顯著小于WKY-C,SHR-M內(nèi)皮依賴性血管舒張能力顯著高于SHR-C,而SHR-H顯著低于SHR-M(P<0.05)。結(jié)論:中等強度運動訓練可以降低高血壓大鼠血壓、改善內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能,其機制可能與運動降低氧化應激水平相關(guān)。然而,高強度運動則上調(diào)氧化應激水平,加劇了高血壓誘導的內(nèi)皮功能紊亂。
運動強度;高血壓;內(nèi)皮;氧化應激
內(nèi)皮細胞主要以旁分泌方式分泌血管活性物質(zhì),作用于臨近的組織、細胞。內(nèi)皮細胞分泌的活性物質(zhì)包括血管舒張因子(EDRF)和血管收縮因子(EDCF),兩者共同作用于血管張力的調(diào)控。但是,在高血壓的病理條件下,全身阻力血管處于高應力狀態(tài),通過打破EDRF和EDCF之間的平衡,直接造成內(nèi)皮細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變和功能的失調(diào),加重高血壓的發(fā)生和發(fā)展。在已有研究中,高血壓大鼠模型中選用不同類型的動脈,如:大動脈(主動脈、頸動脈)、微血管(腎血管、腸系膜動脈),都存在著內(nèi)皮依賴性血管舒張功能的下降。內(nèi)皮功能紊亂是由多因素共同產(chǎn)生的[11],其中氧化應激(Oxidative Stress,OS)是最關(guān)鍵的因素。OS是一種氧化水平與抗氧化水平的失衡狀態(tài),不同程度氧化應激水平使活性氧簇(reactive oxidative species,ROS)對機體產(chǎn)生不同的效應。適宜的ROS水平,使機體適應性的上調(diào)酶和非酶抗氧化物的含量,使ROS發(fā)揮正常的生理功能,對機體產(chǎn)生正向作用。如果ROS大量蓄積而引起氧化損傷,可能會導致大分子,如DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)的改變和破壞,甚至危及到細胞死亡和組織損傷[5,9]。因此,有研究將抗氧化物應用于內(nèi)皮功能紊亂和相關(guān)的心血管疾病的治療中。研究發(fā)現(xiàn),對伴有內(nèi)皮功能紊亂的冠狀動脈疾病,可通過注射維生素-C調(diào)節(jié)氧化應激水平,提高NO生物利用度,達到治療的效果[14]。有學者提出,對高血壓大鼠模型注射SOD1,研究結(jié)果表明,實驗組大鼠血壓顯著下降[23]??寡趸锏闹委熤饕ㄟ^減少ROS的生成,降低OS水平,從而達到降壓效果。然而,ROS并不是單純對機體產(chǎn)生不利影響,它是機體正常代謝的產(chǎn)物,運動、衰老、炎癥都伴隨ROS的產(chǎn)生。
《中國高血壓基層管理指南》(下文簡稱《指南》)明確表明,改善長期生活方式是治療高血壓的基石,運動是改善生活方式的重要一環(huán)。《指南》推薦高血壓患者選擇中等運動方式,進行每周5~7次,每次持續(xù)30 min的運動,這是對運動作為預防和治療高血壓疾病的認可[2]。研究表明,定期有氧運動是一種有效的干預策略,可以改善疾病狀態(tài)下內(nèi)皮依賴性血管舒張能力,如慢性心臟衰竭和高血壓[28]。長期的運動鍛煉可以使機體產(chǎn)生適應性的變化,從而提高心血管的功能。然而,在選擇運動作為治療手段時,運動處方往往會選擇中低強度的有氧運動,對于不同強度運動,尤其是中等強度和高強度運動對高血壓疾病的內(nèi)皮功能和超微結(jié)構(gòu)影響如何,以及不同運動強度下氧化應激水平會如何調(diào)控內(nèi)皮功能,目前國內(nèi)外研究尚少。本研究以不同運動強度下氧化應激水平對內(nèi)皮的功能性影響為立足點,探究高血壓運動治療方法的有效運動負荷。
本實驗擬用自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)和正常血壓大鼠(Wistar Kyoto,WKY)隨機分為安靜對照組和運動組。運動組以中等強度和高強度進行跑臺運動,觀察不同運動強度下的系統(tǒng)血壓、內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)和功能的變化,探討氧化應激在其中的作用機制,為運動療法的量——效關(guān)系以及運動處方的制定提供實驗依據(jù)。
1.1 實驗動物與實驗方案
本實驗選用3月齡雄性高血壓大鼠(SHR,n=24)和同齡的正常血壓大鼠(WKY,n=24),體重約250 g,由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。將SHR、WKY隨機分成安靜組(SHR-C,n=8;WKY-C,n=8)和運動組。運動組根據(jù)不同運動強度分成高血壓中等強度運動組(SHR-M,n=8)、普通血壓中等強度運動組(WKY-M,n=8)、高血壓高強度運動組(SHR-H,n=8)和正常血壓高強度運動組(WKY-H,n=8)。全部動物由北京體育大學動物房飼養(yǎng),保持室溫約22℃,濕度保持40%~45%,國家標準嚙齒類動物分籠飼養(yǎng),自由飲水。
1.2 尾動脈血壓的測量
訓練前和8周訓練后采用尾動脈無創(chuàng)血壓測試儀(BP-2010A,軟隆科技有限公司,日本)測量各組大鼠的收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)。
1.3 血清氧化應激指標的檢測
大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg),麻醉開腹后用粗紗布去除腹部筋膜和其他組織,找到下腔靜脈進行采血,取血后在離心機上以3 500 r/min離心15 min,取上層血清并儲存于-80℃,直到下次進行血清指標的分析時取出。
1.4 透射電鏡檢測
麻醉開腹后迅速取下腸系膜動脈(mesenteric artery,MA),剝離周圍組織,防止組織自溶現(xiàn)象,在最短時間內(nèi)投入4℃2.5%戊二醛固定液,并在固定液中過夜。次日用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液沖洗3次,每次至少15 min;沖洗完畢進行脫水步驟,應梯度進行:70% 丙酮15 min→80% 丙酮15 min→90%丙酮15 min→100% 丙酮20 min(10 min×2);組織進行浸透和包埋,形成包埋塊室溫儲存;超薄切片染色后JEOL JEM-1230(日本)透射電鏡進行觀察并攝片。
1.5 微血管張力測定
麻醉開腹后迅速取出腸系膜動脈組織,置于4℃ Na-Hepes緩沖液的平皿中。選取一小段含MA零級及其含有三級分支的血管,固定于含有4℃ Na-Hepes緩沖液的膠皿。在體視顯微鏡下輕輕剪去MA上的脂肪組織,暴露出腸系膜動、靜脈,辨別出靜脈,去除靜脈后剪取4段約1.5 mm長的三級MA備用。為保證血管活性,全程杜絕牽扯。將一根2 cm左右長的鎢絲穿進備好的三級MA管腔中,并固定在內(nèi)含5 mL Na-Hepes(pH=7.4,T=37℃)離體微血管環(huán)張力測定儀上,在儀器上操作將另一根鎢絲穿入管腔。浴槽持續(xù)通95% O2-5% CO2的混合氣,保持浴槽溫度37℃。調(diào)節(jié)微調(diào)標尺,稍稍將血管擴張,張力調(diào)零平衡20 min,此后張力穩(wěn)定保持在0 mN之后緩慢持續(xù)增加血管張力,當血管基礎張力穩(wěn)定維持在1 mN左右停止。平衡后,動脈血管環(huán)浴槽中加藥觀察血管收縮、舒張功能。固定離體血管環(huán)后,每輪加藥后用5 mL Na-Hepes三次洗脫,等到血管環(huán)張力穩(wěn)定在1 mN左右進行下一輪加藥。
Na-Hepes緩沖液成分(mmol/L):121.1 NaCl、10 Hepes、15.16 KCl、2.4 MgSO4、11.08 Glucose,1.6 CaCl2。
1.6 數(shù)據(jù)分析
2.1 不同強度運動對大鼠血壓的影響
訓練前和8周正式訓練末對各組大鼠進行無創(chuàng)血壓測定,結(jié)果表明:訓練末WKY-M和WKY-H與正常血壓安靜組相比,收縮壓(SBP)均顯著下降(P<0.05);然而,SHR-M SBP水平顯著低于SHR-C(P<0.05),而SHR-H組不僅顯著高于SHR-C,亦顯著高于SHR-M(P<0.05)。正常血壓運動組與正常血壓安靜組舒張壓(DBP)無顯著性差異(P<0.05),但SHR-M、SHR-H與SHR-C存在顯著性差異(P<0.05),具體表現(xiàn)為SHR-M DBP顯著低于SHR-C;SHR-H則顯著高于SHR-M和SHR-C(P<0.05)。此外,訓練末SHR-M和SHR-H SBP和DBP均與各自訓練前結(jié)果存在顯著性差異(P<0.05,表1)。
表 1 不同強度運動對大鼠血壓的影響Table 1 The Effects of Exercise with Different Intensity on Rats’Blood Pressure (mmHg)
注:Initial指訓練前,F(xiàn)inal指8周正式訓練末;SBP為收縮壓;DBP為舒張壓。*表示P<0.05,與WKY-C進行比較;#表示P<0.05,與SHR-C比較;+表示P<0.05,與SHR-M比較;$表示P<0.05,與Initial比較。
2.2 不同強度運動對氧化應激水平的影響
2.2.1 丙二醛(MDA)
SHR-C組(10.9±1.2 nmol/mL)血清MDA含量與WKY-C(8.5±0.6 nmol/mL)比較,均值有升高趨勢,但是不具有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。SHR-H(21.0±3.1 nmol/mL)MDA含量顯著高于SHR-C組(P<0.05),亦顯著高于SHR-M組(10.7±2.0 nmol/mL,P<0.05),而SHR-M組與SHR-C組比較并不存在顯著性差異(P>0.05,圖1A)。
2.2.2 谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)
GSH-Px是機體重要的過氧化物分解酶,它特異的催化還原性谷胱甘肽對過氧化氫產(chǎn)生還原反應。SHR-C組GSH-Px酶活力顯著低于WKY-C(SHR-C:1 348.1±42.5 U;WKY-C:1 562.6±68.9 U,P<0.05)。不同強度的高血壓運動組與高血壓安靜組相比均表現(xiàn)出抗氧化物酶GSH-Px顯著增加(P<0.05),但SHR-M與SHR-H兩組間不具有顯著性差異(SHR-M:1 639.2±119.5 U:SHR-H:1 685.1±35.00 U,P>0.05,圖1B)。
圖 1 血清氧化應激指標柱狀圖Figure1. Indicators of OxidativeStress in Serum
注:MDA:丙二醛;GSH-Px:谷胱甘肽過氧化物酶;SOD:過氧化物歧化酶;Cu/Zn-SOD為SOD的分型。 *P<0.05,與WKY-C進行比較;#P<0.05,與SHR-C比較;+P<0.05,與SHR-M比較。
2.2.3 過氧化物歧化酶(SOD)
血清總SOD(T-SOD)測定顯示,WKY-M組(232.9±3.6 U/mL)顯著高于WKY-C組(217.7±0.6 U/mL,P<0.05),WKY-H與WKY-C、WKY-M相比均無統(tǒng)計學差異。此外,高血壓不同強度運動組與高血壓安靜組均沒有統(tǒng)計學差異(圖1C)。
Cu/Zn-SOD是SOD的分型,與內(nèi)皮依賴性超極化因子發(fā)生有關(guān)。8周運動后,正常血壓運動組無論中強度還是高強度運動,Cu/Zn-SOD均顯著高于WKY-C組(WKY-C:163.9±4.0 U/mL;WKY-M:226.5±6.3 U/mL;WKY-H:211.8±19.7 U/mL,P<0.05)。SHR-C組Cu/Zn-SOD(213.0±1.6 U/mL)顯著高于WKY-C(P<0.05),SHR-M、SHR-H與SHR-C相比均無顯著性差異,SHR-M與SHR-H之間亦不具有統(tǒng)計學差異(圖1D)。
2.3 內(nèi)皮細胞的超微結(jié)構(gòu)
透射電鏡實驗結(jié)果顯示,WKY組MA內(nèi)皮細胞呈扁平狀,表面可見微絨毛,內(nèi)膜連續(xù)性完好、內(nèi)彈力膜平直與內(nèi)皮細胞伴行,平滑肌排列較整齊;SHR組腸系膜動脈內(nèi)皮細胞失去正常形態(tài),核大而畸形,內(nèi)皮細胞呈指狀突向內(nèi)腔,表面微絨毛結(jié)構(gòu)消失,細胞器脫落形成空泡,內(nèi)彈性模不規(guī)則,大量膠原纖維增生至內(nèi)膜層。中等強度運動逆轉(zhuǎn)高血壓內(nèi)皮細胞形態(tài),內(nèi)皮細胞較完整;高血壓高強度運動組內(nèi)皮細胞核大,不規(guī)則,出現(xiàn)空泡狀結(jié)構(gòu),大量膠原纖維增生(圖2)。
圖 2 大鼠腸系膜動脈內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)圖Figure2. Ultrastructure of Endothlial Cells of Mesenteric Artery of Rats 注:EC:內(nèi)皮細胞; IEL:內(nèi)彈性膜;COL:膠原纖維。
2.4 不同強度運動對腸系膜動脈內(nèi)皮功能的影響
2.4.1 去甲腎上腺素(NE)誘發(fā)的血管收縮反應
為排除微血管個體差異,先以KCL(60 mmol/L)誘導三級腸系膜動脈離體微血管環(huán)收縮,以產(chǎn)生的最大收縮張力作為100%Kmax。反應達平臺加入5 mL Na-Hepes進行3次洗脫,保持血管環(huán)張力值穩(wěn)定1 mN約10 min。后續(xù)實驗中,加入去甲腎上腺素(norepinephrine,NE,10-5mol/L)誘發(fā)MA收縮,均將其張力標準化為Kmax百分比(%KMAX),以%KMAX作為評價血管收縮反應性的指標。各組對KCL反應的血管張力分別是(mN):WKY-C(5.98±0.90);WKY-M(6.39±0.14);WKY-H(5.96±0.29);SHR-C(6.00±0.22);SHR-M(5.98±0.18);SHR-H(6.00±0.27),組間無顯著性差異(P>0.05)。
NE(10-5M)誘發(fā)收縮在SHR-C組為190.6%Kmax±9.1%Kmax,與WKY-C(175.5%Kmax±8.3%Kmax)相比無顯著差異(P>0.05)。進行運動干預后,給WKY施與不同強度運動與正常血壓安靜組(WKY-C)相比均具有顯著性差異(P<0.05),WKY-H亦與WKY-M存在顯著性差異(WKY-M:154.1%Kmax±2.3%Kmax;WKY-H:198.2%Kmax±9.1%Kmax,P<0.05)。然而,SHR-M(155.8%Kmax±5.1%Kmax)與SHR-C的血管收縮反應性相比顯著降低 (P<0.05); SHR-H(200.2%Kmax±10.8%Kmax)血管收縮反應性與SHR-C沒有顯著性差異,但顯著高于SHR-M(P<0.05,圖3)。
2.4.2 不同強度運動對內(nèi)皮舒張功能的影響
為評價血管內(nèi)皮依賴性血管舒張水平,常用遞增濃度的乙酰膽堿(ACh)進行實驗[10]。為比較不同強度運動對內(nèi)皮舒張功能的影響,本實驗進行了如下步驟:1)加入KCL(60 mmol/L)待血管張力達到平臺時,Na-Hepes 3次洗脫;2)加入NE(10-5mol/L),待血管張力達到平臺時,在浴槽依次加入半對數(shù)遞增濃度的ACh(10-9-10-5mol/L)。如圖4所示,在10-5mol/L NE刺激下,浴槽中依次加入ACh誘發(fā)MA血管環(huán)舒張,MA舒張百分比隨ACh濃度的升高呈濃度依賴性增加。
圖 3 NE誘發(fā)大鼠腸系膜動脈收縮張力比較Figure 3. Comparison of the Tension Increase Induced by NE in Mesenteric Arteries of Rats
注:*P<0.05,與WKY-C比較;aP<0.05,與WKY-M比較;#P<0.05,與SHR-C比較;+P<0.05,與SHR-M比較。NE為去甲腎上腺素。
圖 4 ACh誘發(fā)的內(nèi)皮依賴性血管舒張反應曲線圖Figure 4. ACh-induced Endothelium-dependent Vasodilation
注:圖中箭頭表示以半對數(shù)遞增濃度方式依次加入乙酰膽堿(ACh:10-9mol/L,3×10-9mol/L,10-8mol/L,3×10-8mol/L,10-7mol/L,3×10-7mol/L,10-6mol/L,3×10-6mol/L,10-5mol/L)。
ACh(10-5mol/L)誘發(fā)的最大血管舒張在SHR-C組為87.2%NE±4.8%NE,顯著小于WKY-C(97.9%NE±1.2%NE,P<0.05)。SHR-M(95.7%NE±1.2%NE)則顯著改善SHR-C內(nèi)皮依賴性血管舒張功能(P<0.05)。然而,SHR-H(66.0%NE±3.0%NE)顯著低于SHR-C和SHR-M內(nèi)皮依賴性血管舒張能力(P<0.05,圖5A)。
利用GraphPad Prism 5.0劑量濃度——反應的非線性回歸曲線計算得出EC50。pIC50 是EC50的負對數(shù),pIC50值表示對藥物的敏感性,值越高表示對藥物的敏感性越高。各組由ACh誘發(fā)的內(nèi)皮依賴性血管pIC50分別為:WKY-C(7.65±0.06);WKY-M(7.58±0.03);WKY-H(7.99±0.01);SHR-C(7.10±0.15);SHR-M(7.65±0.05);SHR-H(6.47±0.07)。WKY-H pIC50顯著高于WKY-C和WKY-M(P<0.05)。SHR-C組pIC50顯著低于WKY-C組(P<0.05)。SHR-M組顯著高于SHR-C組pIC50(P<0.05),而SHR-H組則顯著低于SHR-C(P<0.05)。不同運動強度間比較,WKY-H組 pIC50顯著高于WKY-M(P<0.05),SHR-H組 pIC50顯著低于SHR-M(P<0.05,圖5B)。
圖 5 ACh誘發(fā)內(nèi)皮依賴性血管舒張的劑量-反應曲線Figure 5. Dose-Response Curve of ACh-induced Endothelium-dependent Vasodilation
注:圖A為ACh誘發(fā)內(nèi)皮依賴性血管舒張的劑量反應曲線,縱坐標將NE誘發(fā)MA收縮張力峰值作為100%。圖B為ACh劑量反應的pIC50比較。pIC50,ACh誘導血管舒張達50%的藥物濃度負對數(shù),反映血管對藥物的敏感性。*P<0.05,與WKY-C進行比較;#P<0.05,與SHR-C比較;aP<0.05,與WKY-M比較;+P<0.05,與SHR-M比較。
硝普鈉(SNP)作用于平滑肌細胞使血管舒張,舒張百分比隨SNP的升高濃度呈依賴性增加。本研究結(jié)果,6組均可以完全舒張,無統(tǒng)計學差異,排除了各組間由于平滑肌作用帶來的舒張差異(圖6)。
2.4.3 氧化應激對內(nèi)皮依賴性血管舒張的作用
為檢測氧化應激對各組血管舒張功能的貢獻程度,我們進行了如下實驗:1)加入KCL(60 mmol/L)待血管張力達到平臺時,Na-Hepes3次洗脫;2)加入NE(10-5mol/L),待血管張力達到平臺時,在浴槽依次加入半對數(shù)遞增濃度的ACh;3)加入NAD(P)H氧化酶抑制劑Apocynin(3×10-4mol/L)孵育15 min,加入NE(10-5mol/L),待血管張力達到平臺時,依次加入遞增濃度ACh。觀察ACh最大濃度下血管舒張百分比,比較加藥前、后舒張百分比是否存在統(tǒng)計學差異。
Apocynin預孵育15 min后,在NE的刺激下,離體微血管環(huán)表現(xiàn)出的舒張程度隨ACh濃度的升高呈依賴性的增加。每組對加入Apocynin前后,ACh誘發(fā)血管最大舒張百分比進行前后對照,只有SHR-H加抑制劑Apocynin前與加藥后具有顯著性差異(P<0.05,表2)。
圖 6 SNP誘發(fā)非內(nèi)皮依賴性血管舒張的劑量-反應曲線圖Figure 6. Dose-Response Curve of SNP-induced Endothelium-independent Vasodilation
注:SNP誘發(fā)非內(nèi)皮依賴性血管舒張的劑量反應曲線,縱坐標將NE誘發(fā)MA收縮張力峰值作為100%。
本研究以SHR和WKY為對象,觀察了不同強度運動對其腸系膜動脈內(nèi)皮結(jié)構(gòu)及功能的影響,并探討了氧化應激在其中的可能作用機制。
有研究對不同月齡SHR長期施加低強度游泳運動訓練,結(jié)果顯示:長期低強度游泳運動使青年鼠和成年鼠都會產(chǎn)生降低動脈血壓的效果[34]。有學者提出,長期中等強度有氧運動可以使高血壓患者SBP降低約6~10 mmHg,而DBP降低約4~8 mmHg[15]。然而,高強度對自發(fā)性高血壓的降壓效果如何并沒有明確結(jié)論。本實驗對高血壓大鼠施加中等強度和高強度運動,與正常血壓組進行對照,闡述運動強度與系統(tǒng)血壓之間的量——效關(guān)系。本實驗結(jié)果顯示,高血壓組中等強度運動訓練后SBP和DBP顯著低于高血壓安靜組血壓水平,而高強度運動組顯著高于高血壓安靜組所測血壓值。因此,高血壓組施加不同運動強度會產(chǎn)生相反的效果,即高血壓大鼠進行長期中等強度運動可以有效降低SBP和DBP;高血壓大鼠進行長期高強度運動明顯提高高血壓大鼠SBP和DBP。對比訓練前和后的血壓值,高血壓安靜組顯示安靜血壓隨增齡顯著上升,這與前人研究結(jié)果一致[13]。有研究表明,中等強度運動對高血壓大鼠內(nèi)皮功能[19]和抗氧化功能[4]產(chǎn)生積極影響,有利于對血壓的調(diào)控。高強度運動對高血壓大鼠血壓產(chǎn)生不利影響可能與內(nèi)皮功能紊亂、血管張力調(diào)控功能下降有關(guān),進而影響血壓。有研究表明,高強度運動會導致高血壓大鼠eNOS磷酸化水平降低,增加eNOS依賴活性氧的增加,影響內(nèi)皮功能[6]。氧化應激可以誘導血管進行重構(gòu),改變正常的生理過程,產(chǎn)生內(nèi)皮功能紊亂,影響血管收縮、舒張功能。所以,本文以氧化應激角度,研究不同強度運動對高血壓內(nèi)皮功能影響的分子機制。
表 2 Apocynin對ACh誘發(fā)內(nèi)皮依賴性最大舒張的影響Table 2 Effect ofApocyninon the Maximum Percentage of Endothelium-dependent VasodilationInduced by ACh
注:由NE收縮離體微血管環(huán)達到張力峰值作為100%最大反應,ACh舒張離體微血管環(huán),以最大Relaxation(%NE)表示內(nèi)皮依賴性血管舒張水平。Control組是正常ACh誘發(fā)微動脈最大舒張,Apocynin組是在血管收縮前加入NAD(P)H氧化酶抑制劑,由ACh誘發(fā)微動脈最大舒張百分比。$ P<0.05,與各自空白對照組進行比較。
氧化應激是高血壓等心血管疾病共同的病理生理過程,它在高血壓防治中已被作為治療靶點[18,29]。研究發(fā)現(xiàn),對老年大鼠進行36周的運動訓練并沒有改變心臟脂質(zhì)過氧化物的生物標記物,即反映機體MDA含量的TBARS水平并沒有發(fā)生改變,是因為運動使大鼠體內(nèi)發(fā)生適應性變化,誘導減少由于單個運動周期所產(chǎn)生的暫時性的氧化應激狀態(tài)[33]。運動由于增加了10~20倍的氧消耗,使通過線粒體產(chǎn)生的ROS大量增加[30]。在運動中ROS的產(chǎn)生作為信號物質(zhì),可以使細胞在運動下適應地產(chǎn)生相關(guān)的抗氧化物酶的增加[17]。研究不同運動強度下氧化應激指標的變化,是誘導內(nèi)皮功能改變、影響血壓變化的重要機制之一。氧化應激水平由氧化產(chǎn)物與抗氧化物酶之間的平衡關(guān)系所評價,最常見的指標是MDA(氧化產(chǎn)物的代表),GSH-Px和SOD(抗氧化物酶的代表)[25]。本實驗結(jié)果顯示,SHR-C的MDA含量與WKY-C相比有增加趨勢,但不具有顯著性差異,這可能與樣本量少有關(guān)。SHR-H的氧化應激產(chǎn)物MDA和抗氧化酶指標GSH-Px都表現(xiàn)出增加,但是,前者增加了約1倍,后者增加了約0.3倍,反映出氧化和抗氧化的平衡重心向氧化一邊傾斜;SHR-M與SHR-C相比,SHR-M的MDA含量雖然不變,但是抗氧化物酶GSH-Px顯著增加,表現(xiàn)抗氧化能力的增加。有研究表明,一次力竭運動后會使ROS產(chǎn)物增加,運動后抗氧化物酶含量增加是運動中產(chǎn)生氧化應激機制的反饋。本實驗中,不同強度運動的高血壓大鼠均表現(xiàn)出抗氧化物酶GSH-Px顯著增加,這可能是對運動過程對產(chǎn)生的大量氧化產(chǎn)物所表現(xiàn)的適應性。GSH-Px酶活力在運動后產(chǎn)生的變化眾說紛紜。有學者報道與本實驗GSH-Px結(jié)果相似,運動會使GSH-Px活力上升[30,20-21]。然而,也有研究表明運動使高血壓GSH-Px活力下降[22,31]。當然,還有部分研究支持在運動后GSH-Px活力并沒有發(fā)生變化[8,12,16]。Kamal等對大鼠給予3種不同的運動方式,即耐力運動、阻力運動、耐力加阻力運動,分別對其氧化應激水平以及抗氧化物酶進行比較。研究結(jié)果顯示,3組不同的運動方式均使氧化應激水平下降(MDA含量的下降和SOD酶活力的增加),但是,一些抗氧化物酶(CAT、GSH-Px)活力變化趨勢是不同[24]。所以,抗氧化物酶活力變化趨勢不同,可能與實驗對象的選擇、運動方式、運動強度和運動時間有關(guān),這還需進一步的研究。
長時間的適宜強度運動可刺激氧化產(chǎn)物和抗氧化物酶的生成、減少許多慢性疾病的風險,但是,過多的ROS可以攻擊細胞的成分,內(nèi)皮亦是其攻擊靶點,可以改變內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)和功能[7]。有研究報道,SHR血管內(nèi)皮細胞變形,細胞核增大,細胞膜向管腔呈指狀突起[10],這與我們的結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn),中等強度運動有益于高血壓大鼠內(nèi)皮細胞的完整,而高強度運動則加重了內(nèi)皮細胞的畸形和凋亡。內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)伴隨高血壓疾病發(fā)生改變,結(jié)構(gòu)的改變必然會影響其正常生理功能,影響內(nèi)皮發(fā)揮血管舒張的能力。本研究中的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能實驗,也為此提供了有利證據(jù)。
有研究表明,通過外源性抗氧化物治療可以調(diào)節(jié)氧化應激水平,改善內(nèi)皮功能紊亂??寡趸锏闹委熤饕ㄟ^降低活性氧簇的生成、降低氧化應激水平、改善內(nèi)皮功能,進而達到降壓效果[14]。所以,內(nèi)皮功能的正常發(fā)揮與氧化應激水平密切相關(guān)。有學者提出,適當?shù)幕钚匝醮厮綍a(chǎn)生正向作用,機體可以產(chǎn)生一些適應性變化,即機體本身的負反饋產(chǎn)生更多的抗氧化物酶;然而,在活性氧簇水平很高的情況下,對機體DNA、細胞、組織產(chǎn)生攻擊,并且誘導血管進行重構(gòu),改變正常的生理過程,產(chǎn)生內(nèi)皮功能紊亂、血管張力調(diào)控能力下降,影響血管收縮、舒張功能[1]。本實驗中,觀察了高應力狀態(tài)下外周阻力血管——MA收縮反應性和舒張功能的變化,以及不同運動強度調(diào)控內(nèi)皮功能的氧化應激機制。本研究結(jié)果表明,SHR-H血清MDA含量顯著高于SHR-C組,高強度運動使高血壓大鼠產(chǎn)生大量活性氧簇,發(fā)生大量的脂質(zhì)過氧化物損傷,證實了高血壓大鼠進行高強度運動內(nèi)皮功能紊亂是由于過氧化物的產(chǎn)生,而抗氧化物酶不足以清除大量氧化代謝產(chǎn)物,氧化應激水平嚴重。從離體血管功能性檢測中發(fā)現(xiàn),通過向離體血管環(huán)浴槽中加入NAD(P)H抑制劑Apocynin,比較各組加藥前后ACh誘發(fā)最大內(nèi)皮依賴性血管舒張,評價各組氧化應激在調(diào)控內(nèi)皮功能中的貢獻程度。實驗結(jié)果表明:加入Apocynin后,各組ACh誘發(fā)血管舒張均不存在顯著性差異,說明各組ACh誘發(fā)最大內(nèi)皮依賴性血管舒張存在的差異源自氧化應激的作用,這與Fernanada研究冠狀動脈在NAD(P)H氧化酶抑制劑Apocynin作用下內(nèi)皮依賴性最大舒張水平相似[32]。其中,SHR-H加入Apocynin前后對應的ACh誘發(fā)血管最大內(nèi)皮依賴性舒張之間具有顯著性差異,說明了高強度運動造成高血壓組內(nèi)皮功能紊亂主要與氧化產(chǎn)物大量蓄積有關(guān),即SHR-H內(nèi)皮功能下降主要是因為氧化應激水平的增加。相反,中等強度運動的高血壓大鼠減少血清氧化應激水平,在內(nèi)皮舒張功能性的檢測中表現(xiàn)出SHR-M組改善了高血壓誘導的內(nèi)皮功能紊亂,加入抑制劑Apocynin前后對應的血管最大舒張百分比不具有統(tǒng)計學差異,說明中等強度運動通過降低氧化應激水平影響內(nèi)皮舒張功能。
不同運動強度調(diào)控高血壓誘導的內(nèi)皮功能紊亂,中等強度運動通過下調(diào)氧化應激水平達到增加內(nèi)皮功能的效果,而高強度運動增加氧化應激水平,加劇了高血壓大鼠血管內(nèi)皮功能障礙。
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Oxidative Stress Mechanisms of Treadmill with Different Intensity on Endothelial Function and Ultrastructure in Spontaneously Hypertensive Rats
YE Fang,BAI Ping,ZENG Fan-xing,SHI Li-jun
Objective:To investigate the effects of treadmill exercise with different intensity on spontaneously hypertensive rats’endothelial function and ultrastructure.Methods:Three-month-old male SHR and WKY were randomly assigned to six groups:sedentary control group (SHR-C,WKY-C),moderate-intensity exercise group (SHR-M,WKY-M),and high-intensity exercise group (SHR-H,SHR-H).The animals in the exercise-trained groups ran on a motor treadmill (0° slope) at 18~20 m/min (~55~65% of the maximal aerobic velocity) and 26~28m/min (~75~85% of the maximal aerobic velocity),respectively.Each exercise-trained group ran 60 min per day,5 days per week for 8 weeks.Blood pressure examined by non-invasive methods,endothelial ultrastructure observed by transmission electron microscope,tension test to isolated vessel ring measured by DMT,protein determined by western blotting and detection for enzyme activity.Result:1)Systolic pressureand diastolic pressure in SHR-M were much lower than in SHR-C,and SHR-H significantly different from SHR-C(P<0.05).2)Oxidative product MDA demonstrated that compared to MDA in WKY-C,SHR-C had the trend to rise,but no significant difference.SHR-H were significantly higher than SHR-M (P<0.05).Antioxidant enzymes including GSH-Px,SOD demonstrated that GSH-Px in SHR-C were lower in comparison with WKY-C,GSH-Px in SHR-H and SHR-M were significantly higher compared to SHR-C (P<0.05);SOD in WKY-M were significantly higher than in WKY-C (P<0.05),SOD in SHR exercise-trained groups had no significant difference compared to SHR-C(P<0.05).3)Transmission electron microscope in SHR-C and SHR-H showed that endothelial cells’ malformation,collagen proliferation.However,SHR-M showed the intact of endothelial cells.4)Endothelial-dependent vasodilator function in SHR-C was strikingly lower in comparison with WKY-C,SHR-M ameliorated endothelium-dependent dilation dysfunction induced by hypertension;However,endothelial-dependent dilation was apparently decreased in SHR-H compared to SHR-C (P<0.05).Conclusion:Moderate-intensity exercise can reduce the SHR blood pressure,ameliorate endothelial function and ultrastructure.Whereas high-intensity exercise has an opposite effect that the increase of oxidative stress and the disorder of endothelium dependent dilation.
exerciseintensity;hypertension;endothelium;oxidativestress
1000-677X(2016)12-0058-09
10.16469/j.css.201612008
2016-09-20;
2016-12-05
中央高校基本科研業(yè)務費專項基金資助(2015ZD008);國家體育總局科研課題(2015B035)。
葉芳(1991-),女,安徽人,在讀博士研究生,主要研究方向為運動和心血管生理學,E-mail:15600612858@163.com。
北京體育大學 運動與體質(zhì)健康教育部重點實驗室,北京 100084 Beijing Sport University,Beijing 100084,China.
G804.7
A