連世超，雷夢林，張瑞軍，白志元，張海平，衛(wèi)保國

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所，農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030031）

大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的標(biāo)記定位

連世超1，雷夢林2，張瑞軍2，白志元2，張海平2，衛(wèi)保國2

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所，農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030031）

利用三系法生產(chǎn)大豆雜交種能夠有效提高大豆產(chǎn)量。為挖掘大豆三系育性恢復(fù)基因，利用大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育系SXCMS1A與恢復(fù)系A(chǔ)HH-8構(gòu)建F2育性分離群體，開展不育系育性遺傳分析及育性恢復(fù)基因初定位研究。結(jié)果表明，F(xiàn)1群體花粉鏡檢為半不育，成熟期植株結(jié)實(shí)正常；F2群體花粉鏡檢可育株與半不育株的分離比為1∶1，成熟期植株結(jié)實(shí)正常無不育株，從而推測該大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育系為單基因配子體不育。利用SSR標(biāo)記對F2群體進(jìn)行分析，獲得了位于D1a連鎖群上的2個與恢復(fù)基因緊密連鎖的標(biāo)記Satt184和Satt267，遺傳距離分別為17.3，10.2 cM。因此，將恢復(fù)基因定位于D1a連鎖群上，可為下一步精確定位恢復(fù)基因奠定基礎(chǔ)。

大豆；細(xì)胞質(zhì)雄性不育；恢復(fù)基因；SSR標(biāo)記

雜種優(yōu)勢利用是提高作物單產(chǎn)的重要途徑之一[1]，在水稻、玉米、高粱、油菜等作物中已被廣泛應(yīng)用。隨著大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育三系配套技術(shù)的完成，利用大豆三系生產(chǎn)雜交種已步入應(yīng)用階段[2-4]。大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育的遺傳特點(diǎn)和基因定位的研究將有助于深入了解大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育的遺傳機(jī)制，為精確定位該基因和進(jìn)一步克隆基因奠定基礎(chǔ)。

近年來，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用，國內(nèi)外研究者已對不同作物的細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因進(jìn)行定位研究[5-8]。在大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的定位研究中，趙麗梅等[9]利用YA×167的F2分離群體及YA×（YB×167）群體在J連鎖群上獲得了與恢復(fù)基因連鎖的2個標(biāo)記Satt414，Satt596，與恢復(fù)基因的距離分別為16.4，14.6 cM。任良真[10]利用組合JLCMS9A×JLR2的F2分離群體，將恢復(fù)基因同樣定位在J連鎖群上，獲得了3個連鎖標(biāo)記JS22，JS30，JS51，遺傳距離分別為7.6，10.7，5.2 cM。Yang等[11]將NJCMS1A的2個恢復(fù)基因分別定位在M和A1連鎖群上。另外，Dong等[12-15]利用不同材料分別將恢復(fù)基因定位于J，D2，A，O連鎖群上?？梢姡牧?、群體、方法不同，其結(jié)果也存在差異，反映了大豆現(xiàn)有細(xì)胞質(zhì)雄性不育性的遺傳基礎(chǔ)比較復(fù)雜。因此，本研究針對山西當(dāng)?shù)貎?yōu)良恢復(fù)系的恢復(fù)基因進(jìn)行標(biāo)記定位仍然具有區(qū)域代表性。

近30 a，山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所大豆課題組致力于大豆雜種優(yōu)勢利用研究與應(yīng)用，從大量的雜交組合和多年多點(diǎn)的試驗(yàn)中篩選出一批優(yōu)良的恢復(fù)系材料，其恢復(fù)率表現(xiàn)穩(wěn)定。本研究利用分子標(biāo)記輔助選擇篩選與恢復(fù)基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記，不僅可將恢復(fù)基因定位到具體的染色體上，為進(jìn)一步克隆該恢復(fù)基因奠定基礎(chǔ)，同時在選配強(qiáng)優(yōu)勢組合過程中可提高親本選擇的效率。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育系SXCMS1A及恢復(fù)系A(chǔ)HH-8由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所大豆課題組提供。SXCMS1A由中19與JD24連續(xù)回交5代獲得。以SXCMS1A為母本、AHH-8為父本構(gòu)建F1，F(xiàn)2群體，所有材料于2012—2014年在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所榆次東陽大豆試驗(yàn)基地網(wǎng)室內(nèi)嚴(yán)密隔離種植。

1.2 大豆花粉育性鑒定

在大豆盛花期，采摘每株中上部當(dāng)天即將開放的花蕾3朵，用70%酒精固定后，取出花藥用1% I2－KI染色，在高倍（40×）光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，觀察花粉育性，隨機(jī)選取3個視野，分別統(tǒng)計(jì)不育和可育花粉粒的數(shù)目，計(jì)算花粉敗育率。參考趙麗梅等[16]提出的大豆花粉育性判定為標(biāo)準(zhǔn)可育、半不育、不育花粉的敗育率分別為0～10%，10.1%～90%，90.1%～100%，來鑒定植株育性。成熟期可育植株表現(xiàn)為能夠正常成熟，具有大量黃色結(jié)實(shí)莢，無無性莢果，葉片完全脫落；不育株表現(xiàn)為整株呈濃綠色，葉片肥厚不脫落，莖稈粗壯，結(jié)有大量未受精的幼嫩無性莢果。結(jié)合盛花期鏡檢結(jié)果將植株進(jìn)行育性分類。采用χ2適合性測驗(yàn)檢測鑒定結(jié)果。

1.3 DNA提取

在大豆三節(jié)（V3）期，從母本SXCMS1A、父本AHH-8及二者雜交后代F1，F(xiàn)2群體植株上分單株摘取葉片，-80℃保存。采用CTAB[17]法提取葉片DNA，并檢測其濃度和質(zhì)量。

1.4 基因池的構(gòu)建

利用混合分組分析法[18]（bulked segregate analysis，BSA），結(jié)合花粉鑒定結(jié)果，從F2群體中隨機(jī)選取10株可育單株的等量DNA混合構(gòu)成可育基因池；隨機(jī)選取10株半不育單株的等量DNA混合構(gòu)成半不育基因池；隨機(jī)選取10株不育系單株的等量DNA混合構(gòu)成不育基因池。

1.5 SSR標(biāo)記分析

在Soy Base網(wǎng)站（http://soybase.org/）上挑選445對均勻分布在大豆20個連鎖群上的SSR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR體系10 μL：0.5 μL dNTP（2.5 mmol/L），2 μL Primer（10 μmol/L），1 μL 10×PCR buffer，0.1 μL Taq Polymerase（5 U/μL），5 μL模板DNA（10 ng/μL），1.4 μLddH2O。PCR反應(yīng)條件為：94℃5 min；94℃1 min，退火溫度退火30 s，72℃30 s，34個循環(huán)；72℃10 min；4℃保存。PCR儀為BIO-RADC1000 Thermal Cycler。每對SSR引物具有特定的退火溫度，根據(jù)實(shí)際Tm值設(shè)定引物適合的退火溫度，其他程序不變。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染、拍照記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.6 PCR數(shù)據(jù)處理與分析

根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳帶型，與不育基因池帶型一致記錄為a，與半不育帶型一致記錄為h，與可育基因池帶型一致記為b，將統(tǒng)計(jì)結(jié)果記錄在Excel表中。采用作圖軟件Join Map 4.0分析標(biāo)記與恢復(fù)基因之間的連鎖關(guān)系，構(gòu)建分子遺傳圖譜，并計(jì)算遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育的遺傳規(guī)律

2013年母本不育系SXCMS1A經(jīng)鏡檢，花粉平均敗育率為97.44%，成熟期植株表現(xiàn)全部不育。父本恢復(fù)系A(chǔ)HH-8花粉平均可育率為98.11%，成熟期植株表現(xiàn)全部可育。組合SXCMS1A×AHH-8的F1群體共有306株，花粉平均敗育率為53.28%，成熟期植株全部正常結(jié)實(shí)，無不育株。2014年組合SXCMS1A×AHH-8的F2植株共有293株，花粉鏡檢可育、半不育植株數(shù)目分別為139，154株。經(jīng)χ2適合性測驗(yàn)檢測符合可育∶半不育為1∶1（χ2＝0.77，P＝0.38＞0.05，表1），因此，推測該大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育為單基因配子體不育。其遺傳模式為：不育系SXCMS1A S（rfrf）與恢復(fù)系A(chǔ)HH-8 N（RfRf）雜交形成F1S（Rfrf），由于雄配子（rf）不育不能正常傳遞給下一代，F(xiàn)2只能出現(xiàn)S（Rfrf），S（RfRf）2種類型，且比例為1∶1。

表1 F2群體育性分離的適合性測驗(yàn)

2.2 大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因定位

利用可育基因池、不育基因池和半不育基因池對分布于20條連鎖群上的445對SSR引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，位于D1a連鎖群上的標(biāo)記Satt184，Satt267擴(kuò)增產(chǎn)物表現(xiàn)特異的多態(tài)性。標(biāo)記Satt184，Satt267均在可育基因池和不育基因池中分別擴(kuò)增出一條與可育親本和不育親本帶型一致的特異帶。因此，將恢復(fù)基因定位于D1a連鎖群上。用引物Satt184，Satt267對F2群體進(jìn)行單株驗(yàn)證，結(jié)果除部分單株發(fā)生交換外（其中，引物Satt267在可育植株中11，14號和18號單株發(fā)生交換，在半不育植株中26，33，40號和41號單株發(fā)生了交換），可育植株擴(kuò)增的帶型同可育基因池擴(kuò)增的帶型一致（圖1，2，3）。

2.3 遺傳作圖分析

根據(jù)F2群體293個單株對應(yīng)的2個引物擴(kuò)增結(jié)果，用Join Map 4.0軟件對2個標(biāo)記和1個恢復(fù)基因（暫命為Rf）進(jìn)行遺傳作圖分析，結(jié)果表明，恢復(fù)基因Rf與標(biāo)記Satt184，Satt267的遺傳距離分別為17.3，10.2 cM（圖4）。

3 討論

本研究從親本材料的選擇上，對SXCMS1A和AHH-8的花粉染色、成熟期結(jié)實(shí)率等表型進(jìn)行鑒定，SXCMS1A雄性不育性狀和AHH-8可育性狀的穩(wěn)定性可達(dá)到100%，同時細(xì)胞質(zhì)雄性不育可穩(wěn)定遺傳，其育性受核、質(zhì)基因共同控制，因此，配制組合SXCMS1A×AHH-8對其細(xì)胞質(zhì)雄性不育遺傳規(guī)律的探索完全可行。趙麗梅等[9]、任良真[10]、Dong等[12]和湯復(fù)躍等[14]分別用不同材料對細(xì)胞質(zhì)雄性不育系育性恢復(fù)遺傳模式進(jìn)行研究，結(jié)果表明，這些細(xì)胞質(zhì)雄性不育系材料的育性恢復(fù)遺傳符合單基因配子體不育。本研究中，F(xiàn)1植株花粉敗育率為53.28%，為半不育，初步推斷，該細(xì)胞質(zhì)雄性不育系為單基因配子體不育或孢子體不育的不完全顯性。因此，F(xiàn)2理論上可能出現(xiàn)2種情況：單基因配子體不育的一個顯著特點(diǎn)是不育基因不能通過雄配子傳遞，在F2群體中花粉分離比例為可育∶半不育＝1∶1；孢子體不完全顯性的F2分離比例為可育∶半不育∶不育＝1∶2∶1。實(shí)際檢測到F2群體（293株）可育與半不育植株數(shù)分別為139，154株。經(jīng)χ2適合性測驗(yàn)檢測符合可育∶半不育＝1∶1（χ2＝0.77，P＝0.38＞0.05），因此，推測該大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育屬單基因配子體不育，這與趙麗梅等[9]、任良真[10]、Dong等[12]和湯復(fù)躍等[14]的研究結(jié)果一致。由此推測，以上研究中的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的不育和恢復(fù)機(jī)理可能是相同的。

運(yùn)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)來定位恢復(fù)基因已成為當(dāng)前研究大豆細(xì)胞雄性不育恢復(fù)基因的重要方法之一。SSR標(biāo)記具有穩(wěn)定性好、重復(fù)性高、費(fèi)用低廉和共顯性等優(yōu)點(diǎn)[19-22]。趙麗梅等[9-15]分別將不同的恢復(fù)基因定位在J，J，（M，A1），J，D2，A1，O連鎖群上。本研究以組合SXCMS1A×AHH-8的F2群體為定位群體，利用445對大豆SSR引物對大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育的恢復(fù)基因進(jìn)行定位，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記Satt184，Satt267與恢復(fù)基因緊密連鎖，可將恢復(fù)基因定位在D1a連鎖群上，這與前人的定位結(jié)果不同。一方面，可能由于父本材料自身核遺傳背景存在差異，從而形成不同的育性恢復(fù)基因；另一方面，大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的育性遺傳比較復(fù)雜，除了受自身基因控制以外，還容易受到周圍環(huán)境的影響。不同的生理環(huán)境可能會造成花粉育性變化上的差異，最終導(dǎo)致恢復(fù)基因定位結(jié)果的不同。以上推測還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)加以驗(yàn)證。

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Marker Location for Cytoplasmic Male Sterile Restorer Gene in Soybean

LIAN Shi-chao1，LEI Meng-lin2，ZHANG Rui-jun2，BAI Zhi-yuan2，ZHANG Hai-ping2，WEI Bao-guo2
（1.College of Biological Engineering，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau，Ministry of Agriculture，Shanxi Key Laboratory of Genetic Resources and Genetic Improvement of Minor Crops，Institute of Crop Germplasm Resources，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

Utilization of the cytoplasmic male sterile（CMS）line SXCMS1A×AHH-8 constructed F2segregation population, cytoplasmic male sterility restorer gene was located using SSR markers in soybean.The results showed that the F1pollen was semi sterile, but the plants were normal.The separation ratio of fertile plants and semi sterile plants of F2was 1∶1,which was under χ2test.So as to speculate,the soybean cytoplasmic male sterile gene belonged to single-gene gametophyte sterile.445 pairs SSR primers of soybean were chosen to screen the F2segregation population.The restorer gene was located at D1a linkage group.The genetic distances of Satt184 and Satt267 were 17.3,10.2 cM,respectively.The research laid the foundation for further location of restorer gene.

soybean;cytoplasmic male sterile;restorer gene;SSR marker

S565.1

A

1002-2481（2016）05-0579-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.05.03

2016-01-05

科技部“863”計(jì)劃項(xiàng)目（2011AA10A105）；山西省青年科技研究基金項(xiàng)目（2014021029-1）

連世超（1987-），男，山西高平人，在讀碩士，研究方向：作物雜種優(yōu)勢利用。衛(wèi)保國為通信作者。