奧 娜，趙 泓，裴雁曦，王永勤

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，蔬菜種質(zhì)改良北京市重點實驗室，北京100097）

大蔥AfCER1基因的克隆及表達分析

奧 娜1，2，趙 泓2，裴雁曦1，王永勤2

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，蔬菜種質(zhì)改良北京市重點實驗室，北京100097）

基于大蔥RNA-seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中蠟質(zhì)相關(guān)基因AfCER1的序列設(shè)計引物，利用RT-PCR（Reverse transcription-polymerase chain reaction）和RACE（Rapid amplification of cDNA ends）技術(shù)獲得AfCER1（Allium fistulisum CER1）的全長cDNA序列，并通過生物信息學(xué)手段分析基因的序列；利用RT-PCR和Real-time PCR分析AfCER1基因在大蔥野生型和突變型植株中的空間表達模式。結(jié)果表明，AfCER1基因全長為2 144 bp，包含一個1 857 bp完整的開放閱讀框（ORF），編碼618個氨基酸。蛋白序列比對分析表明，AfCER1與其他物種的CER1具有相似的結(jié)構(gòu)域：脂肪酸羥化酶結(jié)構(gòu)域和WAX2-C結(jié)構(gòu)域。由RT-PCR的結(jié)果可知，AfCER1基因在大蔥的根、葉鞘、葉片等部位均有表達，且在野生型和突變型植株中的表達量有差異。Real-time PCR分析表明，在大蔥的根和葉鞘及剛見光的葉片中，AfCER1在突變型植株中的表達量相對野生型少；而在見光較多的葉片部位，AfCER1在突變型植株中的表達量卻比野生型多。研究可為大蔥蠟質(zhì)合成的分子機制提供理論基礎(chǔ)。

大蔥；蠟質(zhì)；AfCER1；基因克??；表達分析

表皮蠟質(zhì)是大多數(shù)陸地植物角質(zhì)層的重要組成部分，覆蓋于陸地植物的表皮，可以減緩陸地植物對生物和非生物的脅迫，如防止干旱、病蟲害，病原體和紫外輻射對植物的侵害[1-2]，是植物的保護屏障。受遺傳多樣性和后天發(fā)育的影響，不同植物物種、器官和組織中蠟質(zhì)的成分和含量不同[3-5]。如擬南芥[6-8]、水稻[9-10]和番茄[11-12]的突變型與野生型植株相比蠟質(zhì)發(fā)生改變，表現(xiàn)為植物地上部分的表面蠟質(zhì)晶體稀少，對干旱的敏感性增強。另外，角質(zhì)層蠟質(zhì)減少也與器官融合和繁殖率下降相關(guān)[6，13-14]。

蠟質(zhì)的各種脂類組分由飽和的超長鏈脂肪酸及其衍生物組成。C16和C18脂肪酸在質(zhì)體中合成后輸出到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，經(jīng)過脂肪酸延伸酶復(fù)合體催化生成C20～C34的超長鏈脂肪酸（VLCFAs）[15-16]。在擬南芥中，莖的表皮蠟由烷烴、醛、脂肪酸、伯醇、蠟酯、仲醇類和酮類組成，其中，80%～90%是烷烴、仲醇和酮[17-18]。蠟質(zhì)的主要成分由2個途徑合成：酰基還原途徑合成伯醇和烷基酯，脫羰基途徑合成醛類、烷烴、酮和仲醇[18]。在擬南芥cer1-1突變體中烷烴、仲醇、酮含量下降，而醛的含量增加[19-21]，推測CER1基因編碼的是一種醛脫羰酶[19-20]。最近研究表明，CER1與CER3和細(xì)胞色素b5亞型（CYTB5s）相互作用[22]。此外，在雙子葉和單子葉物種中，CER1蛋白結(jié)構(gòu)具有保守性，且富含組氨酸的基序，表明生物體中的CER1同源蛋白擁有相似的功能[19]。

表皮蠟質(zhì)的形成機制和調(diào)控已成為研究熱點。大蔥（Allium fistulosum）是我國傳統(tǒng)的蔬菜和調(diào)味品之一，其葉片表皮覆蓋有明顯的蠟質(zhì)，是研究蠟質(zhì)合成機制的最佳材料，但迄今仍未見大蔥蠟質(zhì)合成的相關(guān)基因及蠟質(zhì)形成分子機制的研究報道。

本試驗克隆了大蔥的蠟質(zhì)相關(guān)基因AfCER1，并對其基因序列、蛋白序列進行了生物信息學(xué)分析，最后分析了AfCER1在大蔥野生型和突變型植株中的空間表達模式，旨在初步了解大蔥中的AfCER1基因，并預(yù)測AfCER1在大蔥蠟質(zhì)形成中的重要作用，為大蔥蠟質(zhì)合成的分子機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試大蔥材料來自北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心試驗田，從試驗田中采集“鞭稈”大蔥的野生型和突變型植株（圖1-A），突變型植株與野生型相比表現(xiàn)為葉片少蠟、有光澤。為了研究蠟質(zhì)AfCER1基因在植株各部位的表達量，試驗將植株細(xì)分為五大部分：根、鱗莖盤、葉鞘（圖1-B）、倒數(shù)第3葉出葉口及葉片，其中，葉鞘又分別從1/4，1/2，3/4長度處取材，葉片分為見光葉片和不見光葉片，見光葉片又分別從1/4，1/2，3/4部位取材，不見光葉片從最長葉葉片1/2處、最長葉葉鞘1/2處取材，每株植株總計11個取材部位。所有取材部分均取自5株植物的混合樣品，取材完畢后將樣品放于液氮中運回實驗室立即提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。克隆AfCER1基因用的材料為大蔥的見光葉片混合材料，RT-PCR和Real-time PCR選用11個取材部位的cDNA。

本試驗所用引物采用Primer 5軟件進行設(shè)計（表1），由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，試驗中所有引物濃度均為10 μmol/L。

表1 引物及序列

1.2 方法

1.2.1 大蔥RNA的提取及第1鏈cDNA的合成大蔥各部位總RNA提取步驟參照華越洋RNA提取試劑盒具體說明書（北京華越洋生物科技有限公司）。以RNA為模板、寡聚核苷酸B26為引物合成第1鏈cDNA，詳細(xì)步驟參照PrimeScriptⅡ1st Strand cDNASynthesis Kit（TaKaRa，大連）說明書。

1.2.2 RACE獲得3′端cDNA序列 根據(jù)實驗室前期研究工作，已經(jīng)對大蔥葉片進行了RNA-seq測序，從數(shù)據(jù)庫中選取CER1基因序列的保守區(qū)設(shè)計引物S-L和S-R，得到基因的中間序列，根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計3′端特異性引物C1，以葉片cDNA為模板、C1和B26為引物，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃1 min，共32個循環(huán)；72℃5 min。瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物，參照Quick Gel Extraction Kit說明書（北京全式金生物技術(shù)有限公司），使用TransGen載體將目的片段連接到pEASY-T5載體（北京全式金生物技術(shù)有限公司）上，轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌（北京全式金生物技術(shù)有限公司）中，挑取白斑進行12 h左右的培養(yǎng)，菌液PCR鑒定后將陽性克隆送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。

1.2.3 RACE獲得5′端cDNA序列 根據(jù)CER1基因中間片段測序結(jié)果設(shè)計5′端的特異性引物C2和C3，結(jié)合5′錨定引物AP和巢式引物NP，進行巢式PCR擴增。第1輪以加Poly（c）尾的cDNA為模板，以AP和C2為引物，擴增程序為：94℃預(yù)變性3min；94℃30 s，56.5℃30 s，72℃1 min，共32個循環(huán)；72℃5 min。第2輪以第1輪PCR擴增產(chǎn)物為模板，以NP和C3為引物擴增，擴增程序為：94℃預(yù)變性3 min；94℃30 s，55.5℃30 s，72℃1 min，32個循環(huán)；72℃5 min?？寺〉哪康钠慰寺〉絋載體后送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。

1.2.4 比對同源蛋白序列和構(gòu)建系統(tǒng)進化樹 使用DNAMAN軟件將測序后獲得的cDNA兩端序列與中間序列進行拼接，得到大蔥CER1的全長序列。為了分析大蔥與其他物種CER1基因的同源性，將該基因的蛋白序列及其他物種的同源蛋白序列進行比對分析，同時使用MEGA 6.0軟件將CER1基因序列和其他物種的CER1基因序列用鄰近相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行Bootstrap1000次檢測分析。

1.2.5 RT-PCR和Real-time PCR分析AfCER1的空間表達模式 以各個部位的cDNA為模板、C-L和C-R為引物，進行RT-PCR擴增。洋蔥18SRNA引物作為內(nèi)參基因，特異引物為18SRNA-F和18SRNA-R。再以各個部位的cDNA為模板、C-L和C-R為特異引物，18SRNA-F和18SRNA-R為內(nèi)參引物，用熒光染料法（SYBR Green，天根生化科技（北京）有限公司）進行實時熒光定量表達分析，使用羅氏公司的Roche480實時定量PCR擴增儀，每個試驗重復(fù)3次。使用Microsoft Excel處理得到的數(shù)據(jù)，參照2-ΔΔCt計算法計算相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 AfCER1序列及其分析

AfCER1基因中間片段、3′端目的片段和5′端目的片段分別為645，492，1 236 bp（圖2）。利用DNAMAN軟件將3條序列進行拼接，得到AfCER1基因全長（2 144 bp）。分析結(jié)果顯示，在野生型和突變體植株中克隆得到的AfCER1序列一致，基因全長包含1個48 bp的5′非編碼區(qū)；1個1 857 bp完整的開放閱讀框（ORF），編碼618個氨基酸，推測蛋白分子量為71.08 kD，等電點為8.99；1個239 bp的3′非編碼區(qū)，該非編碼區(qū)含有植物mRNA典型的Poly（A）尾序列。蛋白序列分析表明，AfCER1含有2個結(jié)構(gòu)域，其N端含有一個脂肪酸羥化酶區(qū)域，C端含有一個被命名為WAX2-C的功能未知域（圖3）。

2.2 蛋白序列比對及其系統(tǒng)進化分析

將預(yù)測的AfCER1序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST檢索，結(jié)果表明，其氨基酸序列與香蕉MaCER1-like（68%）、谷子 SiCER1-like（66%）、玉米ZmCER1（65%）、野生稻ObCER1-like（65%）、小麥TaCER1（63%）、番茄 SlCER1-like（63%）、葡萄VvCER1-like（63%）、黃瓜CsCER1（62%）、蓮NnCER1（62%）、巨桉EgCER1-like（61%）等物種CER1的氨基酸序列有很高的同源性。大蔥CER1的蛋白結(jié)構(gòu)中有典型的脂肪酸羥化酶結(jié)構(gòu)域和WAX2 C-末端結(jié)構(gòu)域，其脂肪酸羥化酶結(jié)構(gòu)域的序列中包含3個保守的HXHH基序，而WAX2C-末端結(jié)構(gòu)域存在一個保守的LEGW序列基序（圖4）。

進化樹分析可知，按照序列的遠(yuǎn)近分為雙子葉植物和單子葉植物，大蔥作為單子葉植物，與雙子葉植物的蘋果、番茄、馬鈴薯等親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，而與油棕、香蕉等親緣關(guān)系相對較近（圖5）。

2.3 AfCER1基因在大蔥不同部位的表達分析

為了確定AfCER1基因在野生型和突變型大蔥中的空間表達模式，對大蔥的不同部位進行了半定量RT-PCR分析，結(jié)果表明，AfCER1基因在大蔥的根、葉鞘、葉片等部位均有表達，在根、不見光最長葉葉片1/2處的野生型和突變型中均只有少量表達；在鱗莖盤、葉鞘3/4處和葉片1/4處野生型和突變型的表達量有明顯差異，其余部位的表達量差異不顯著（圖6）。

2.4 AfCER1在大蔥中的空間表達模式

為了進一步闡明AfCER1在大蔥不同部位的表達模式，對大蔥的不同部位進行了實時熒光定量PCR（Real-time PCR），結(jié)果表明，在大蔥的根、葉鞘及剛見光的葉片中，AfCER1在突變型植株中的表達量相對野生型少，而在見光較多的葉片部位AfCER1在突變型中的表達量較野生型多。在表型蠟質(zhì)含量明顯差異的2個大蔥品種中，AfCER1基因的表達量有明顯的差異（圖7）。

3 討論

3.1 AfCER1可能是整合膜蛋白

大蔥AfCER1蛋白序列與其他物種的CER1序列有較高的相似性，且所有的CER1均有2個典型的結(jié)構(gòu)域：脂肪酸羥化酶結(jié)構(gòu)域和WAX2-C結(jié)構(gòu)域，其中，同源蛋白區(qū)脂肪酸羥化酶結(jié)構(gòu)域含有3個保守的富含組氨酸的基序（HX3H，HX2HH和HX2HH，其中X代表任意氨基酸），該域?qū)γ傅幕钚杂兄匾淖饔肹23]，包含這種結(jié)構(gòu)域的酶可能是一種整合膜蛋白，參與膽固醇和植物表皮蠟的合成；而在烷類中起作用但功能仍未知的WAX2 C-末端結(jié)構(gòu)域[6]，經(jīng)常會在真核生物中發(fā)現(xiàn)，存在一個保守的LEGW序列基序，可能與脂肪酸羥化酶區(qū)域有關(guān)。

3.2 AfCER1基因可能影響大蔥表皮蠟質(zhì)的積累

陸生植物表皮蠟質(zhì)存在于地上部器官的組織表皮，且蠟質(zhì)是在表皮細(xì)胞中合成并運輸?shù)奖砥ね鈁24]。大部分植物蠟質(zhì)的主要成分是烷類，占蠟質(zhì)總量的50%～80%[18-20]。關(guān)于蠟質(zhì)基因研究較為透徹的植物是擬南芥，其中包括CER1在內(nèi)的很多蠟質(zhì)基因已被鑒定和研究。在擬南芥cer1突變體中，烷類及其衍生物的含量下降較為明顯，而醛類的含量有所上升，是編碼醛脫羧酶的基因，可以將醛催化成烷烴[21]。另外，有研究表明，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的CsCER1在黃瓜蠟質(zhì)烷類的合成中起到了關(guān)鍵作用[25]；在大桐巖中，SsCER1基因也是一個蠟質(zhì)基因，與蠟質(zhì)的形成相關(guān)[26]。

擬南芥中CER1的表達量分析顯示，表達量的改變可以影響超長鏈烷烴的合成，進而影響蠟質(zhì)的合成。T-DNA插入等位基因突變體的蠟質(zhì)缺乏超長鏈烷烴及其衍生物，而CER1過表達顯著地增加了奇數(shù)碳的烷烴和異支鏈烷烴的積累[20]。而本研究中比較了AfCER1在大蔥的野生型和突變型植株中的表達，結(jié)果表明，AfCER1在大蔥的各個部位均有表達，說明蠟質(zhì)遍布于植株的各個部位，但是在大蔥野生型和突變體植株的不同部位，AfCER1的表達量發(fā)生了很大的改變，尤其在突變體的葉片部位，AfCER1的表達量較高，大蔥葉片中AfCER1的調(diào)節(jié)作用可能與擬南芥中CER1過表達時的作用相似，導(dǎo)致生成奇數(shù)碳的烷烴和異支鏈烷烴增多，進一步影響蠟質(zhì)的積累。綜上推測，AfCER1可能參與了大蔥表皮蠟質(zhì)的合成，但是具體的調(diào)節(jié)作用及代謝途徑，仍需進一步驗證。

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Cloning and Expression Analysis of AfCER1Gene in Welsh Onion

AO Na1，2，ZHAO Hong2，PEI Yan-xi1，WANG Yong-qin2
（1.College of Life Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops（North China），Ministry of Agriculture，Beijing Vegetable Germplasm Improvement Laboratory，Beijing Vegetable Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing100097，China）

The wax-related gene CER1 primer design was based on RNA-seq transcriptome database of welsh onion,the AfCER1 gene full sequence length was obtained by RT-PCR（Reverse transcription-polymerase chain reaction）and RACE（Rapid amplification of cDNA ends）technology,and then analyzed its basic structure in NCBI.The differentially expression in wild and mutant plants was analyzed using RT-PCR and Real-time PCR technology.The results showed that the AfCER1 full-length cDNA was 2 144 bp,and contained an 1 857 bp open reading frame（ORF）which encoded 618 amino acids.The protein sequence alignment result showed that AfCER1 had a fatty acid hydroxylase region and a WAX2-C domain,which was similar to the CER1 functional domains of other species. RT-PCR results indicated that AfCER1 gene was expressed in root,leaf sheath and leaf,there were differences in the expression of wild and mutant plants.Real-time PCR results indicated that AfCER1 less expressed in mutant compare to wild in root,leaf sheaths and leaves.However,AfCER1 gene higher expressed in the lighted leaves of mutant plants.This study provides a theoretical basis for the molecular mechanism of wax synthesis of welsh onion.

welsh onion;wax;AfCER1;gene cloning;expression analysis

S633.1

A

1002-2481（2016）05-0569-07

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.05.01

2016-02-25

國家自然科學(xué)基金項目（31372066）；北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項（KJCX201101010）

奧 娜（1989-），女，山西呂梁人，在讀碩士，研究方向：大蔥表皮蠟質(zhì)形成機制。裴雁曦、王永勤為通信作者。