■胡丹丹 郭婷婷 金亞?wèn)| 徐曉鋒

(寧夏大學(xué)，寧夏銀川 750021)

低聚糖又稱為寡糖，一般是由2～10個(gè)單糖以糖苷鍵聚合而成的直鏈或者支鏈的聚合物的總稱。低聚糖主要分為功能性低聚糖和普通性低聚糖兩大類。普通性低聚糖可以被動(dòng)物體消化吸收，而功能性低聚糖無(wú)法被動(dòng)物體消化利用。國(guó)內(nèi)外對(duì)寡糖的研究和應(yīng)用起始于單胃動(dòng)物，在反芻動(dòng)物的研究報(bào)道中也越來(lái)越受到重視。據(jù)Heinrichs等[1]報(bào)道，甘露寡糖能夠使奶牛的胃腸道微生物態(tài)環(huán)境得到優(yōu)化，促使雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益菌繁殖，抑制大腸桿菌等有害菌的生長(zhǎng)。Sharon等[2]證明寡糖可以與一些毒素等表面結(jié)合，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，保障奶牛的健康。Zhang X F等[3]通過(guò)在綿羊的瘤胃、十二指腸中灌注寡糖，可以增強(qiáng)綿羊的免疫功能，促進(jìn)綿羊?qū)θ占Z中低聚糖的利用。許多專家學(xué)者證明寡糖具有改善腸道菌群，提高免疫力等益生作用，因此可以作為優(yōu)良的飼料添加劑在生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用。為了進(jìn)一步的驗(yàn)證低聚糖對(duì)瘤胃發(fā)酵的作用，本試驗(yàn)旨在利用體外法研究不同功能性低聚糖對(duì)瘤胃發(fā)酵與微生物蛋白合成的影響，為在畜牧養(yǎng)殖飼料中添加不同功能性低聚糖的合理應(yīng)用提供科學(xué)、可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

果寡糖（FOS，純度為90%）、甘露寡糖（MOS，純度為50%）、大豆寡糖（SBOS，純度為55%）。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及日糧

選取3頭體況良好、體重約600 kg，裝有永久性瘤胃瘺管的中國(guó)荷斯坦奶牛作為瘤胃液供體動(dòng)物，TMR飼養(yǎng)，日糧精粗比為30∶70（風(fēng)干基礎(chǔ)），試驗(yàn)正式期14 d，從第15 d開始收集瘤胃液用于體外培養(yǎng)，體外培養(yǎng)發(fā)酵底物由精料和粗料組成，精粗比為30∶70（風(fēng)干基礎(chǔ)）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)選取甘露寡糖、大豆寡糖、果寡糖三種功能性低聚糖研究對(duì)象，添加水平分別為0%、0.5%、1.5%、3.0%，利用體外批次培養(yǎng)方法，重復(fù)3次，每個(gè)添加水平3個(gè)平行樣，體外批次培養(yǎng)裝置參照盧德勛等[4]和程茂基[5]的方法進(jìn)行。試驗(yàn)動(dòng)物于每日早7:00和晚19:00等量飼喂，自由飲水，試驗(yàn)期21 d，其中預(yù)飼期為7 d，正式期14 d。

1.4 體外產(chǎn)氣與培養(yǎng)

1.4.1 緩沖液配制

每升緩沖液中含Na2HPO41.43 g、KH2PO41.55 g、NaHCO38.75 g、NH4HCO31.00 g、MgSO4·7H2O 0.15 g、CaCl2·2H2O 3.3 g、MnCl2·4H2O 2.5 g、FeCl2·6H2O 0.2 g、CoCl2·6H2O 0.25 g、Na2S9·H2O 0.37 g。

1.4.2 瘤胃液的采集

于晨飼前0.5 h通過(guò)瘤胃瘺管分別采集3頭奶牛的瘤胃內(nèi)容物，采集的內(nèi)容物立即放入保溫瓶中帶回實(shí)驗(yàn)室，等體積混合，在厭氧和保溫（39℃）條件下用攪拌器劇烈震蕩3次以上，每次30 s,保證附著在飼料顆粒上的微生物脫落，然后用四層紗布過(guò)濾。

1.4.3 混合培養(yǎng)液的配制

收集的瘤胃液用四層紗布過(guò)濾，持續(xù)充入CO2氣體5 min，與緩沖液的配比為1∶2，然后迅速轉(zhuǎn)移至已預(yù)熱好并通有CO2的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)（1 000 ml），接注射器，記錄初始讀數(shù)，然后開始培養(yǎng)。

1.5 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.5.1 產(chǎn)氣量的測(cè)定

從培養(yǎng)開始后，分別于2、4、6、12、24、48、72 h各時(shí)間點(diǎn)通過(guò)玻璃注射器記錄1次產(chǎn)氣量。

1.5.2 產(chǎn)氣動(dòng)力學(xué)指標(biāo)計(jì)算

根據(jù)Φrskov等(1979)[6]的產(chǎn)氣模型公式將各種樣品在2、4、6、12、24、48、72 h各時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量代入，應(yīng)用Neway curve-fitting程序（麥考利土地利用研究所，2004）計(jì)算消化動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

GP=a+b(1-e-ct)

式中：GP——產(chǎn)氣量；

a——快速發(fā)酵部分的產(chǎn)氣參數(shù)；

b——慢速發(fā)酵部分的產(chǎn)氣參數(shù)；

c——產(chǎn)氣速率；

t——產(chǎn)氣時(shí)間。

1.5.3 發(fā)酵參數(shù)測(cè)定

1.5.3.1 VFA的測(cè)定

利用日本島津GC-7A氣相色譜儀以內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定瘤胃VFA[7]，內(nèi)標(biāo)物為巴豆酸。

1.5.3.2 氨態(tài)氮的測(cè)定

利用苯酚-次氯酸鈉比色法測(cè)定瘤胃氨態(tài)氮的含量[8]。

1.5.3.3 乳酸測(cè)定

利用對(duì)羥基聯(lián)苯法對(duì)瘤胃乳酸的量進(jìn)行測(cè)定。

1.5.3.4 微生物蛋白的測(cè)定

利用嘌呤堿基法對(duì)瘤胃微生物蛋白進(jìn)行測(cè)定[9]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

飼料樣品的產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣參數(shù)、發(fā)酵參數(shù)運(yùn)用EXCELL 2003和SAS 8.2中析因設(shè)計(jì)的方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用最小顯著法SNK進(jìn)行差異顯著性比較，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 不同功能性低聚糖對(duì)瘤胃體外產(chǎn)氣參數(shù)的影響

添加不同功能性低聚糖對(duì)瘤胃體外產(chǎn)氣參數(shù)的影響見(jiàn)表1，從表1可以看出，隨著低聚糖添加量的增加，各組內(nèi)潛在產(chǎn)氣量極顯著提高（P＜0.01），不同功能性低聚糖添加處理對(duì)潛在產(chǎn)氣量影響差異顯著（P＜0.05），在3%的添加水平下呈現(xiàn)出大豆寡糖添加組最高，甘露寡糖添加組次之，而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，對(duì)潛在產(chǎn)氣量影響差異不顯著（P＞0.05）。對(duì)于體外產(chǎn)氣速率，隨著低聚糖添加量的增加，各組內(nèi)產(chǎn)氣速率差異不顯著（P＞0.05），不同功能性低聚糖添加處理對(duì)產(chǎn)氣速率影響差異不顯著（P＞0.05），而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，對(duì)產(chǎn)氣速率影響差異不顯著（P＞0.05）。對(duì)于快速降解部分，隨著低聚糖濃度的增加，快速降解部分也隨之極顯著地提高（P＜0.01），不同功能性低聚糖添加處理對(duì)快速降解部分影響差異不顯著（P＞0.05），而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，對(duì)快速降解部分影響差異不顯著（P＞0.05）。對(duì)于慢速降解部分，隨著低聚糖濃度的增加，慢速降解部分極顯著提高（P＜0.01），不同功能性低聚糖添加處理對(duì)慢速降解部分影響差異顯著（P＜0.05），在3%的添加水平下，呈現(xiàn)出大豆寡糖最高，甘露寡糖添加組次之，而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，對(duì)慢速降解部分影響差異不顯著（P＞0.05）。

表1 不同功能性低聚糖對(duì)瘤胃體外產(chǎn)氣指數(shù)的影響

2.2 不同功能性低聚糖對(duì)瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)的影響

添加不同功能性低聚糖對(duì)瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響見(jiàn)表2，從表2可看出，三種不同功能性低聚糖，隨著添加量的增加對(duì)總揮發(fā)性脂肪酸、乙酸/丙酸值、氨態(tài)氮均有顯著影響(P＜0.05)，對(duì)乳酸影響不顯著，但有降低的趨勢(shì)(P＞0.05)。對(duì)于總揮發(fā)性脂肪酸，隨著低聚糖添加量的增加極顯著提高總揮發(fā)性脂肪酸的量（P＜0.01），不同功能性低聚糖添加處理對(duì)其影響差異極顯著（P＜0.01），而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，對(duì)總揮發(fā)性脂肪酸影響差異顯著（P＜0.05）。對(duì)于乙酸/丙酸值，隨著低聚糖添加量的增加，乙酸/丙酸值顯著增加（P＜0.05），不同功能性低聚糖添加處理對(duì)其影響差異不顯著（P＞0.05），而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，對(duì)乙酸/丙酸值影響差異不顯著（P＞0.05）。對(duì)于氨態(tài)氮，隨著低聚糖添加量的增加，各添加組組內(nèi)氨態(tài)氮極顯著降低（P＜0.01），不同功能性低聚糖添加處理對(duì)其影響差異極顯著（P＜0.01），呈現(xiàn)出大豆寡糖添加組最低，果寡糖次之，而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，對(duì)氨態(tài)氮影響差異顯著（P＜0.05）。對(duì)于乳酸，添加組組內(nèi)差異不顯著（P＞0.05），但隨著添加量的增加，有降低的趨勢(shì)，不同功能性低聚糖添加處理對(duì)其影響差異極顯著（P＜0.01），其中甘露寡糖添加組乳酸要低于其余兩組，而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，對(duì)乳酸影響差異不顯著（P＞0.05）。

表2 不同功能性低聚糖對(duì)體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

2.3 不同功能性低聚糖對(duì)體外瘤胃微生物蛋白合成的影響

添加不同功能性低聚糖對(duì)體外瘤胃微生物合成的影響見(jiàn)表3，從表3可看出，低聚糖的添加極顯著提高微生物蛋白的合成，不同功能性低聚糖添加處理對(duì)其影響差異極顯著（P＜0.01），而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，對(duì)微生物蛋白合成影響差異不顯著（P＞0.05）。對(duì)于微生物蛋白合成效率，隨著低聚糖濃度的增加，微生物蛋白合成效率顯著提高（P＜0.05），但在果寡糖添加組，添加組組內(nèi)差異不顯著（P＞0.05），不同功能性低聚糖添加處理對(duì)其影響差異極顯著（P＜0.01），呈現(xiàn)出甘露寡糖添加組最高，大豆寡糖次之，而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，對(duì)微生物蛋白合成效率影響差異不顯著（P＞0.05）。

表3 不同功能性低聚糖對(duì)體外瘤胃微生物蛋白合成的影響

3 討論

3.1 不同功能性低聚糖對(duì)瘤胃體外產(chǎn)氣量的影響

瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的氣體以CO2和CH4為主，主要途徑以瘤胃內(nèi)微生物發(fā)酵。王新峰等[10]通過(guò)在斷奶羔羊日糧中添加低聚果糖、低聚異麥芽糖，研究發(fā)現(xiàn)，異麥芽寡糖和果寡糖能改變斷奶羔羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)，增加瘤胃菌群的數(shù)量，提高產(chǎn)氣量。戈婷婷等[11]通過(guò)在日糧中添加不同水平甘露寡糖，發(fā)現(xiàn)隨著添加量的增加，瘤胃產(chǎn)氣量顯著增加。但是對(duì)于產(chǎn)氣量，各學(xué)者研究結(jié)果不同，劉光斌等[12]研究表明，在日糧中添加不同水平的大豆寡糖，產(chǎn)氣量變化不明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，不同種類與不同添加水平低聚糖均顯著提高瘤胃體外產(chǎn)氣量，尤其在日糧中添加甘露寡糖對(duì)體外產(chǎn)氣量影響效果最顯著，說(shuō)明在日糧中添加功能性低聚糖能夠改善瘤胃微生物發(fā)酵功能。

3.2 不同功能性低聚糖對(duì)瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)的影響

3.2.1 不同功能性低聚糖對(duì)瘤胃揮發(fā)性脂肪酸的影響

揮發(fā)性脂肪酸是碳水化合物在奶牛瘤胃中發(fā)酵產(chǎn)生的主要物質(zhì)，是反映瘤胃發(fā)酵和對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力的重要指標(biāo)。據(jù)研究證明，揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)生，可能是由于在日糧中添加糖類物質(zhì)，直接影響瘤胃微生物的發(fā)酵[13]和誘導(dǎo)瘤胃微生物數(shù)量的失衡而促進(jìn)瘤胃微生物的發(fā)酵[14]，提高揮發(fā)性脂肪酸的量。Shi等[15]通過(guò)在斷奶仔豬日糧中添加果寡糖，發(fā)現(xiàn)隨著果寡糖的添加，雙歧桿菌極顯著提高，產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸也增加。肖宇[16]研究在混合精料中添加半乳甘露寡糖對(duì)奶山羊瘤胃發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)半乳甘露寡糖的添加能夠顯著提高揮發(fā)性脂肪酸的含量。黃雅莉等[17]研究在日糧中添加果寡糖，發(fā)現(xiàn)隨著果寡糖的添加，瘤胃揮發(fā)性脂肪酸的量顯著增加。Mwenya B等[18]通過(guò)在奶牛日糧中添加低聚糖，發(fā)現(xiàn)隨著低聚糖的添加，瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的總揮發(fā)性脂肪酸也增加。本試驗(yàn)通過(guò)體外法研究三種不同低聚糖對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸的影響，發(fā)現(xiàn)不同低聚糖種類和添加水平對(duì)總揮發(fā)性脂肪酸均有顯著影響，影響程度不同，但對(duì)乙酸/丙酸的值，在甘露寡糖和大豆寡糖添加組乙酸/丙酸的值均顯著增加，而對(duì)于果寡糖添加組，乙酸/丙酸值有降低的趨勢(shì)，這和大多數(shù)研究一致，綜合以上三種功能性低聚糖對(duì)瘤胃揮發(fā)性脂肪酸的影響，發(fā)現(xiàn)大豆寡糖對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵的綜合作用效果最理想。

3.2.2 不同功能性低聚糖對(duì)瘤胃氨態(tài)氮的影響

氨態(tài)氮濃度是評(píng)價(jià)瘤胃內(nèi)環(huán)境的重要指標(biāo)，是日糧蛋白與非蛋白氮在瘤胃中降解的產(chǎn)物。對(duì)于氨態(tài)氮，大多數(shù)研究者觀點(diǎn)不一。Li G H等[19]通過(guò)體外法研究在綿羊日糧中加入不同種類的寡糖，結(jié)果表明，寡糖添加可以顯著降低瘤胃氨態(tài)氮的量。陳志龍等[20]研究在不同精粗比的日糧中添加甘露寡糖，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)后期導(dǎo)致瘤胃中氨態(tài)氮上升的趨勢(shì)，但不呈規(guī)律性變化。凌寶明等[21]研究證明，寡糖的添加，能夠顯著降低瘤胃氨態(tài)氮的量，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果相似。本試驗(yàn)通過(guò)在日糧中添加三種功能性低聚糖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同低聚糖和不同的添加水平均對(duì)瘤胃氨態(tài)氮均有顯著的影響，隨著低聚糖濃度的增加，氨態(tài)氮顯著降低，特別是添加大豆寡糖組對(duì)氨態(tài)氮影響最顯著。作為微生物蛋白合成的前體物質(zhì)和瘤胃微生物發(fā)酵的氮源，氨態(tài)氮應(yīng)處于合適的濃度，濃度過(guò)高會(huì)增加氮循環(huán)中氮素的損失，Hristov A N等[22]認(rèn)為，氨態(tài)氮濃度過(guò)低限制纖維素分解菌分解纖維的能力。對(duì)于氨態(tài)氮的最適濃度，各國(guó)學(xué)者比較一致的認(rèn)為在10～50 mg/dl范圍內(nèi)[23]，本試驗(yàn)研究的氨態(tài)氮的濃度恰好在此范圍內(nèi)。

3.2.3 不同功能性低聚糖對(duì)乳酸的影響

乳酸是反芻動(dòng)物在瘤胃糖代謝中產(chǎn)生中間產(chǎn)物，是反映瘤胃功能好與壞的重要參照指標(biāo)。乳酸在瘤胃中大量的積累，降低瘤胃pH值，導(dǎo)致瘤胃酸中毒現(xiàn)象[24]。現(xiàn)如今即使在大多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家，每年因瘤胃酸中毒就要損失5～10億美元[25]，因此減少瘤胃中乳酸的量，能夠有效防止瘤胃酸中毒現(xiàn)象。本試驗(yàn)通過(guò)在日糧中添加三種功能性低聚糖，研究對(duì)瘤胃代謝產(chǎn)生的乳酸的影響，結(jié)果證明，隨著低聚糖濃度的增加，乳酸的量無(wú)顯著變化，但是有降低的趨勢(shì)，因此在日糧中添加功能性低聚糖對(duì)乳酸的產(chǎn)生有抑制作用，而不同功能性低聚糖添加處理對(duì)乳酸影響差異顯著，其中甘露寡糖對(duì)乳酸的降低最有利。

3.3 不同功能性低聚糖對(duì)體外瘤胃微生物蛋白合成的影響

反芻動(dòng)物瘤胃中的微生物各種各樣，主要包括細(xì)菌、原蟲和真菌，這些厭氧微生物尤其是細(xì)菌把來(lái)自日糧中的蛋白質(zhì)降解為游離氨基酸、小肽和氨，以瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸和CO2為碳架合成微生物蛋白[26]，因此微生物蛋白也是反映瘤胃發(fā)酵的重要指標(biāo)。對(duì)微生物蛋白，研究者們從體內(nèi)和體外方法來(lái)證明添加功能性寡糖對(duì)微生物蛋白的影響。潘珂[27]通過(guò)在基礎(chǔ)日糧基礎(chǔ)上添加甘露寡糖、果寡糖和大豆寡糖功能性寡糖，發(fā)現(xiàn)隨著寡糖濃度的添加，瘤胃微生物蛋白呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。戈婷婷等[28]通過(guò)體外法研究不同水平的甘露寡糖對(duì)瘤胃微生物的影響，發(fā)現(xiàn)隨著甘露寡糖添加量的增加，微生物蛋白量提高。凌寶明等[29]利用體外法研究在綿羊日糧中添加甘露寡糖和果寡糖對(duì)瘤胃微生物蛋白的影響，結(jié)果證明，日糧中添加功能性寡糖能夠顯著提高微生物蛋白的量。本試驗(yàn)通過(guò)體外方法研究不同功能性低聚糖對(duì)瘤胃微生物蛋白的影響中發(fā)現(xiàn)，低聚糖的種類和添加水平均對(duì)瘤胃微生物合成有顯著影響，隨著低聚糖添加量的提高，微生物蛋白的量極顯著增加，不同功能性低聚糖添加處理對(duì)其影響差異顯著。縱觀三種不同的功能性低聚糖對(duì)體外瘤胃微生物蛋白合成的影響，可以發(fā)現(xiàn)3.0%添加水平下大豆寡糖添加組的綜合作用效果要優(yōu)于其他兩組。

4 結(jié)論

在體外條件下，不同功能性低聚糖對(duì)瘤胃發(fā)酵和瘤胃微生物蛋白合成均有影響，通過(guò)在日糧中添加功能性低聚糖，可以明顯改善瘤胃發(fā)酵以及促進(jìn)瘤胃微生物蛋白合成，這種改善取決于功能性低聚糖的種類以及其添加水平。對(duì)于低聚糖添加組，隨著添加水平的增加，可以使瘤胃產(chǎn)氣量、總揮發(fā)性脂肪酸、乙酸/丙酸值、微生物蛋白均顯著提高，使氨態(tài)氮顯著降低，對(duì)于乳酸來(lái)說(shuō)影響不顯著，但是能夠使乳酸呈降低趨勢(shì)。不同功能性低聚糖在不同的添加水平下對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵和微生物合成均產(chǎn)生影響，在綜合潛在產(chǎn)氣量、快速降解部分、慢速降解部分、總揮性脂肪酸、乙酸/丙酸值、氨態(tài)氮、總嘌呤方面，3.0%大豆寡糖添加組要好于其他添加組，即3.0%的大豆寡糖添加組對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵及微生物合成影響最有利。