李 傲，金玉霞

lncRNA EPB41L4A-AS2對卵巢癌細胞SKOV-3凋亡的影響及其機制

李 傲a，金玉霞b*

目的 探討卵巢癌中長非編碼RNA EPB41L4A-AS2差異表達，檢測其對卵巢癌細胞凋亡的影響及其作用機制。方法 從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載并處理新一代測序(RNASEQ V2)數(shù)據(jù)，利用COX單因素風險回歸分析以及K-M生存分析方法，識別與卵巢癌患者預后顯著相關的lncRNA。利用生物信息學方法獲取卵巢癌顯著相關的lncRNA與mRNA共表達網(wǎng)絡，挖掘風險lncRNA有關的互作子網(wǎng)，預測卵巢癌患者生存有關的lncRNA及其功能。同時，通過MTT、AO/EB、Western blot檢測細胞表型及凋亡相關蛋白，進而研究其機制。結果 共識別130個與卵巢癌風險顯著相關的lncRNA(P<0.05)，其中46個風險lncRNA能夠顯著區(qū)分卵巢癌患者的高低生存率；識別了2個重要的風險lncRNA EPB41L4A-AS2(HR=1.72，P=0.000 016 8)和C20orf203(HR=2.07，P=0.04)，其中度最大的為EPB41L4A-AS2。該lncRNA的62個互作基因映射到病毒致癌作用(Viral carcinogenesis pathway)通路中，并且能影響下游信號通路。其lncRNA能通過影響下游增殖通路及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白合成通路誘導卵巢癌。過表達lncRNA EPB41L4A-AS2可影響SKOV-3細胞增殖，同時使Bcl-2家族蛋白的表達下調(diào)，促凋亡蛋白Bax的表達上調(diào)，增加Caspase-3的活性，同時能夠使MAPK信號通路中的p38、JNK、ERK1/2蛋白表達上調(diào)。結論 lncRNA EPB41L4A-AS2通過MAPK信號途徑調(diào)節(jié)卵巢癌細胞系SKOV-3的凋亡，為長鏈非編碼RNA EPB41L4A-AS2成為臨床卵巢癌患者的有效治療藥物提供了新依據(jù)。

長鏈非編碼RNA；共表達網(wǎng)絡；卵巢癌；凋亡

0 引言

卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤，發(fā)病率高居婦科惡性腫瘤第3位，且占全身惡性腫瘤的5%[1]。早期發(fā)現(xiàn)和新的治療方法是減少卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的重要因素，也是臨床研究的重點[2]?，F(xiàn)階段，臨床對于卵巢癌的治療主要以手術治療和化學療法為主，但是，由于盆腹腔的廣泛轉(zhuǎn)移，手術的局限性以及化療后耐藥、復發(fā)等，使得卵巢癌晚期患者5年生存率仍停留在20%～25%[3]，故尋求治療卵巢癌的新物質(zhì)是目前研究的熱點之一。

長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt(核苷酸單位)的功能性RNA分子[4]，可在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達，廣泛參與機體的生理和病理過程[5-6]。此外，大量的數(shù)據(jù)表明，lncRNAs在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[7]。如，lncRNA HULC作為一種內(nèi)源性的海綿轉(zhuǎn)錄因子在癌癥中起重要作用[8]。lncRNA MALAT1在肺癌中是一種重要的生物學標記物[9]。目前發(fā)現(xiàn)的參與哺乳動物基因活動的lncRNA已有上千個，但有關lncRNA EPB41L4A-AS2的功能、機制及其與疾病的關系尚不完全明確。

本文通過生物信息學方法，首先預測了與卵巢癌相關的lncRNAs，篩選出表達量最高的EPB41L4A-AS2，探討過表達lncRNA EPB41L4A-AS2對卵巢癌細胞系SKOV-3細胞增殖、凋亡的影響。同時對于lncRNA EPB41L4A-AS2在卵巢癌中通過何種方式產(chǎn)生作用進行了初步研究。

1 方法與數(shù)據(jù)

1.1 材料 人卵巢癌細胞系SKOV-3由哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科周碎央饋贈，用DMEM高糖(含10%小牛血清)培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)?？笲cl-2、抗Bax、抗p38、抗JNK以及ERK1/2單克隆抗體(美國Cell Signaling)。

1.2 數(shù)據(jù)來源

1.2.1 卵巢癌測序及生存數(shù)據(jù)來源 從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載卵巢癌樣本的外顯子數(shù)據(jù)?？偣舶?09個癌癥樣本?；跇颖镜耐怙@子表達數(shù)據(jù)計算出lncRNA和基因的RPKM表達矩陣。另外，從TCGA數(shù)據(jù)庫下載卵巢癌樣本的臨床數(shù)據(jù)，其中包含樣本名稱、樣本的生存時間和生存狀態(tài)。

1.2.2 單因素Cox風險回歸分析 利用單因素Cox比例風險回歸模型評價全表達譜上的lncRNA表達是否是顯著影響卵巢癌患者生存的獨立危險因素。用Log rank檢驗方法評估顯著性，結果發(fā)現(xiàn)130個與卵巢癌風險顯著相關的lncRNA(P<0.05)，其中93個lncRNA的風險比HR>1，成為卵巢癌不良預后的風險性因素；37個lncRNA的風險比HR<1，成為卵巢癌不良預后的保護性因素。

1.2.3 K-M生存分析 利用上述識別的130個卵巢癌預后有關的風險lncRNA做進一步的K-M生存分析，評價這些lncRNA的表達是否能夠顯著區(qū)分高低生存率的卵巢癌患者，結果顯示，有46個lncRNA能夠顯著區(qū)分卵巢癌患者生存，用Log rank檢驗方法評估顯著性(P<0.05)，如表1所示。

表1 識別的46個風險lncRNA

1.2.4 共表達網(wǎng)絡建立 計算表達譜上任意lncRNA與任意gene表達的皮爾森相關系數(shù)(PCC)，隨機擾動gene與lncRNA標簽100次，重新計算PCC，尋找出16 015對顯著相關的lncRNA-gene關系對(|PCC|>0.6且P<0.01)，其中1 088個lncRNA，4 431個基因。

1.2.5 識別卵巢癌風險lncRNA調(diào)控的下游通路 提取以上46個卵巢癌風險相關lncRNA映射到網(wǎng)絡中，分別提取與每個lncRNA共表達的基因集合，并將該基因集合映射到KEGG通路中尋找下游潛在的風險通路。結果有340對lncRNA-gene被提取出來，其中311個基因，25個lncRNA。

1.3 方法

1.3.1 MTT法測定SKOV-3細胞生長抑制率 將1×104/L的SKOV-3細胞接種于96孔板中，貼壁培養(yǎng)24 h后，向培養(yǎng)細胞中加入lncRNA EPB41L4A-AS2，轉(zhuǎn)染48 h。每組設定6個平行孔，并設定空白對照。在吸光度(A490)檢測。

1.3.2 Caspase-3活性檢測 將各組細胞收集到離心管中，1 500 r/min、4 ℃離心5 min，收集細胞。按Caspase-3活性檢測試劑盒說明書測定Caspase-3酶活性，同時取少量樣品用Bradford法測定蛋白濃度。

1.3.3 Western blot分析蛋白質(zhì)的提取 收集對照組和加入lncRNA EPB41L4A-AS2作用48 h后的SKOV3細胞，加入裂解液60 μL(RIPA∶蛋白酶抑制劑=1∶100)，冰上超聲(60 Hz)打碎，10 min/次，13 500 r/min離心15 min，吸上清。按照BCA法測蛋白濃度。80 μg總蛋白質(zhì)濃度在8%～10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至NC膜，然后將膜置于5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h后，PBS沖洗。加入Bcl-2、Bax一抗(1∶1 000)Bad、p-Bad一抗(1∶500)、p38(1∶500)、ERK1/2(1∶500)及JNK(1∶500)4 ℃過夜。用PBS-T緩沖液洗膜3次，每次15 min，然后用紅外熒光標記二抗(1∶10 000)對膜室溫孵育1 h后，用PBS-T沖洗NC膜3次，每次10 min。利用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)檢測膜上蛋白。

2 結果

2.1 風險lncRNA影響的下游通路 利用上述方法，構建卵巢癌相關lncRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡，共包含16 015對顯著的lncRNA-mRNA關系。共識別130個與卵巢癌風險顯著相關的lncRNA(P<0.05)，其中46個風險lncRNA能夠顯著區(qū)分卵巢癌患者的高低生存率。將這46個風險lncRNA映射到上述共表達網(wǎng)絡當中，映射到25個lncRNA。其中l(wèi)ncRNA EPB41L4A-AS2在單因素Cox風險回歸分析結果中風險比HR=1.72且P=0.000 016 8，因此，其表達成為影響卵巢癌患者生存的風險性因素。

本研究有8個共表達基因被映射到KEGG通路中，MAPK Signaling Pathway被映射出來。在該通路中EPB41L4A-AS2潛在調(diào)控下游基因CACN，而該基因處于通路的起始位置，其表達能夠影響下游增殖通路的活性，如圖1所示。因此，EPB41L4A-AS2表達的異?？赡芡ㄟ^使增殖通路失調(diào)來引起癌癥。

另外，研究顯示，與風險性lncRNA C20orf203(HR=2.07，P=0.04)共表達的7個基因映射出了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白合成過程通路。在該通路中，DSK2基因作為C20orf203的共表達基因，其表達能夠影響下游蛋白酶體通路的活性。有研究發(fā)現(xiàn),蛋白酶體抑制劑在誘導卵巢癌細胞凋亡過程起關鍵作用。因此，風險lncRNA EPB41L4A-AS2的異常表達可能誘發(fā)卵巢癌。

2.2 過表達lncRNA EPB41L4A-AS2對于卵巢癌SKOV-3細胞凋亡通路的影響 為了進一步驗證EPB41L4A-AS2是否通過MAPK信號通路誘導SKOV3細胞凋亡，首先通過MTT、AO/EB等試驗方法檢測了過表達EPB41L4A-AS2后SKOV3細胞活性的變化。結果顯示，轉(zhuǎn)染EPB41L4A-AS2 48 h后，SKOV3活性降低(圖1)。

Western blot方法檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Bad、p-Bad以及Caspase-3活性變化的結果顯示，與對照組相比，過表達EPB41L4A-AS2作用48 h后，SKOV-3細胞中的Bax、Bad蛋白的表達顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(n=3，P<0.05)，而Bcl-2、p-Bad蛋白的表達顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(n=3，P<0.05)，見圖2A、圖2B。同時，通過Caspase-3試劑盒檢測其活性，結果顯示，與對照組相比，Caspase-3活性顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(n=3，P<0.05)，見圖2C。MAPK通路相關蛋白ERK1/2、JNK、p38蛋白檢測結果顯示，lncRNA EPB41L4A-AS2作用48 h后，MAPK信號通路蛋白JNK、ERK1/2、p38蛋白表達與對照組相比明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(n=3，P<0.05)，見圖3。

圖1 lncRNA EPB41L4A-AS2對SKOV3活性的影響

圖2 lncRNA EPB41L4A-AS2對凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Bad、p-Bad水平及Caspase-3活性的影響

圖3 lncRNA EPB41L4A-AS2對MAPK信號通路的影響

3 討論

長鏈非編碼RNA是長度>200個核苷酸的非編碼RNA[10]。研究表明，其廣泛參與各種生物學過程，在表觀遺傳調(diào)控[11]、細胞周期調(diào)控和細胞分化調(diào)控等眾多生命活動中發(fā)揮重要作用，成為遺傳學研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA對于膽囊癌、肝癌、喉癌、胃癌的發(fā)生發(fā)展有著巨大的影響[12]。本文利用生物信息學方法來識別卵巢癌相關的ln-cRNA,我們首先通過處理高通量測序數(shù)據(jù)來識別差異表達的lncRNA。同時構建卵巢癌相關lncRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡，將差異表達的lncRNA映射到該共表達網(wǎng)絡中。Xu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA EPB41L4A-AS2能夠抑制乳腺癌及其他癌癥活性。Takeishi等[14]研究發(fā)現(xiàn)，激活MAPK信號通路能夠增強卵巢癌的進展，導致臨床復發(fā)率升高。因此，針對lncRNA EPB41L4A-AS2是否通過MAPK信號通路來影響卵巢癌活性，我們檢測了Bcl-2、Bad、p-Bad、Bax的變化，以及Caspase-3的活性、MAPK通路的經(jīng)典蛋白的變化。結果顯示，與對照組比較，過表達EPB41L4A-AS2能夠增加Bax/Bcl-2比值[15]，而加入EPB41L4A-AS2-作用48 h后，Caspase-3活性增加，表明EPB41L4A-AS2是通過激活Caspase-3，進而激活MAPK信號通路蛋白，參與SKOV-3細胞凋亡的過程中。

綜上所述，本研究通過生物信息學方法挖掘發(fā)現(xiàn)卵巢癌相關的風險標記基因lncRNA EPB41L4A-AS2，并得出結論，該lncRNA能夠通過MAPK信號通路影響卵巢癌細胞SKOV-3細胞凋亡。因此，本研究有利于更好地理解卵巢癌發(fā)展的潛在分子機制，為卵巢癌的預防、干擾和治療提供一個更廣闊的視角。

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Effect of lncRNA EPB41L4A-AS2 on ovarian cancer cells SKOV-3 and its mechanism

LI Aoa,JIN Yu-xiab*

(a.Department of Anesthesiology,b.Department of Obstetrics and Gynecology,the Second Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150080,China)

Objective To identify the differential expression of lncRNA-EPB41L4A-AS2 in ovarian cancer and explore its anti-tumor mechanism.Methods Prognosis-related lncRNAs in ovarian cancer were identified by COX single factor regression analysis and K-M test using data from The Cancer Genome Atlas (TCGA) database.Then ovarian cancer related lncRNA-mRNA co-expressed network was constructed and prognosis-related sub-network was explored.Furthermore,the functions of lncRNAs were predicted.Finally,apoptotic effects and mechanism of lncRNA EPB41L4A-AS2 were evaluated by MTT,AO/EB and Western blot,respectively.Results A total of 130 lncRNA were identified to be associated with ovarian cancer (P<0.05),of which 46 lncRNAs were significantly related to prognosis in ovarian cancer,including two important lncRNA-EPB41L4A-AS2 (HR=1.72，P=0.000 016 8) and C20orf203 (HR=2.07，P=0.04).We selected EPB41L4A-AS2 for further analysis due to its highest degree (its 62 co-expressed mRNA were annotated to viral carcinogenesis pathway).Finally,we validated that over-expression of EPB41L4A-AS2 could influence the viability of SKOV-3 ovarian cancer cells by enhancing the expression of Bax and activity of Caspase-3 and by reducing the expression of Bcl-2.Meanwhile,over-expression of EPB41L4A-AS2 could increase the expression of p38,JNK and ERK1/2 in MAPK pathway.Conclusion lncRNA EPB41L4A-AS2 might play an oncogenic role in ovarian cancer through MAPK signaling pathway and might serve as a valuable prognostic biomarker and therapeutic target for ovarian cancer patients.

lncRNA;Co-expression network;Ovarian cancer;Apoptosis

2016-05-15

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院a.麻醉科，b.婦產(chǎn)科，哈爾濱 150080

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201612005