史立信，臧穎卓，胡福廣，王清濤，馬志軍，張文超，王傳海

尼莫地平對(duì)彌漫性軸索損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶改變及海馬NF-κB蛋白表達(dá)的影響

史立信1a*，臧穎卓1b，胡福廣2，王清濤1c，馬志軍1d，張文超1a，王傳海1a

目的 研究尼莫地平(Nimodipine，NM)對(duì)彌漫性軸索損傷(Diffuse axonal injury，DAI)大鼠學(xué)習(xí)記憶改變及海馬NF-κB蛋白表達(dá)的影響，探討尼莫地平對(duì)DAI大鼠的腦保護(hù)機(jī)制。方法 將36只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)、DAI組和NM組，每組12只，通過Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)及空間探索實(shí)驗(yàn)，觀察大鼠行為學(xué)改變，并用免疫組化和Western blot方法測定NF-κB蛋白的表達(dá)。結(jié)果 Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)：與NC組比較，DAI組大鼠第1～3天逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)；與DAI組比較，NM組大鼠第1～3天逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：與NC組比較，DAI組大鼠2 min內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P<0.05)；與DAI組比較，NM組大鼠2 min內(nèi)穿越平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)明顯增加(P<0.05)。與NC組比較，大鼠DAI后NF-κB蛋白表達(dá)增加(P<0.05)；與DAI組比較，NM干預(yù)后NF-κB蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 DAI大鼠學(xué)習(xí)記憶能力受損，主要表現(xiàn)為Morris水迷宮中逃避潛伏期延長，平臺(tái)穿越次數(shù)減少。大鼠DAI后NF-κB蛋白表達(dá)增加，可能與軸索繼發(fā)性損傷有關(guān)，NM可能通過抑制NF-κB蛋白的活化來實(shí)現(xiàn)其神經(jīng)保護(hù)作用。

尼莫地平；彌漫性軸索損傷；海馬；NF-κB

0 引言

彌漫性軸索損傷(Diffuse axonal injury，DAI)是指頭部受到加速性、旋轉(zhuǎn)外力作用后，產(chǎn)生的剪切力造成神經(jīng)元軸索腫脹、斷裂及軸索回縮球形成等為特征的一系列病理生理變化。DAI約占重型顱腦損傷的28%～42%，在死亡患者中占29%～43%，是導(dǎo)致顱腦損傷患者神經(jīng)功能障礙、植物狀態(tài)和死亡的主要原因[1-2]。尼莫地平(Nimodipine，NM)可減少血管痙攣引起的缺血性腦損傷，近年來常用于DAI的輔助治療，已成為DAI研究的熱點(diǎn)問題，但其具體作用機(jī)制尚不明確。本研究應(yīng)用鈣拮抗劑NM對(duì)DAI大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察其行為學(xué)改變及海馬NF-κB蛋白表達(dá)的變化，探討尼莫地平對(duì)DAI潛在的腦保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取健康、清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠36只，雌雄各半，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(冀)2010-1-003，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)大鼠體重(220±20) g，環(huán)境溫度22～25 ℃，12 h光亮/黑暗條件，分籠喂養(yǎng)。隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)、DAI組和NM組，每組12只。

1.2 試劑與方法 兔抗NF-κB多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，羊抗兔IgG熒光抗體(美國Rockland公司)，BCA(Bicinchoninic acid)蛋白定量試劑盒(德國Novagen公司)，Western blot遠(yuǎn)紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(美國Odyssey公司)。

1.3 DAI動(dòng)物模型建立、水迷宮制作方法及預(yù)處理 動(dòng)物模型制作：通過瞬間加-減速旋轉(zhuǎn)損傷裝置制作大鼠腦外傷后DAI模型[3]，各組大鼠經(jīng)10%水合氯醛(100 g/L)麻醉后，固定于旋轉(zhuǎn)裝置上，待大鼠劇烈掙扎時(shí)，給予頭顱瞬間旋轉(zhuǎn)90°,重復(fù)8次。

Morris水迷宮制作：Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)由水迷宮裝置、水迷宮圖像自動(dòng)采集和處理分析系統(tǒng)組成(成都泰盟科技有限公司研制)。水迷宮裝置為自制直徑為150 cm、高50 cm的圓形水池，被通過圓心的2條假想的垂直線分成4個(gè)象限，盛水后按0.5%～1.5%比例加入奶粉，混合均勻后水變成不透明乳白色。將一直徑10 cm、高25 cm的圓形透明平臺(tái)隱于水面下1 cm，固定于某一象限，水溫維持在22～25 ℃。

NM治療組：給予NM注射液(山東新華制藥股份有限公司，商品名：尼立蘇，國藥準(zhǔn)字H10950226 規(guī)格：10 mL∶2 mg)腹腔注射，劑量為0.5 mg/(kg·d)，連續(xù)給藥7 d。

1.4 行為學(xué)觀察 實(shí)驗(yàn)第8天起選取DAI組、NC組大鼠各12只，分別行Morris水迷宮檢測，測定大鼠時(shí)間和空間學(xué)習(xí)記憶能力。①定位航行實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)歷時(shí)3 d，每天上下午各測試一組次，每組次每只大鼠從4個(gè)象限各入水1次，記錄逃避潛伏期。如2 min仍未找到平臺(tái)，記錄潛伏期為2 min；②空間探索實(shí)驗(yàn)：定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束的第2天，將平臺(tái)去除，選平臺(tái)相對(duì)象限為入水點(diǎn)，觀察大鼠2 min內(nèi)穿越平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)。

1.5 NF-κB免疫組化染色 行為學(xué)觀察完畢后，每組大鼠隨機(jī)選取4只，于DAI發(fā)作后24 h，采用10%水合氯醛(0.3～0.4 mL/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉。先用0.9%氯化鈉溶液200 mL，再用4%多聚甲醛磷酸緩沖液500 mL，自左心室先快后慢灌注固定。取含海馬腦段，石蠟包埋，冠狀切片，片厚約5 μm。采用抗生物素-生物素-過氧化物酶復(fù)合法[4]進(jìn)行免疫組化染色，每只大鼠約取8張切片，每張切片于CA1區(qū)隨機(jī)抽取3個(gè)視野，測定每個(gè)視野的細(xì)胞總數(shù)、陽性細(xì)胞數(shù)及光密度值，取其平均值。評(píng)定大鼠海馬CA1區(qū)NF-κB蛋白表達(dá)的變化。

1.6 Western blot方法檢測大鼠海馬NF-κB蛋白的變化 每組隨機(jī)抽取4只大鼠，分離海馬后立即提取海馬核蛋白。BCA法測定蛋白含量。稱取50 mg海馬核蛋白加熱，使其變性。用Tris-SDS聚丙烯酰凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉1 h，與多克隆兔抗NF-κB抗體(1∶100) 4 ℃孵育過夜，TPBS緩沖液漂洗，將膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG熒光抗體室溫孵育1 h，洗膜3次，Odyssey遠(yuǎn)紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描觀察顯影，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，與β-actin (1∶500，美國Santa Cruz公司)單位密度值相比后再行統(tǒng)計(jì)學(xué)定量分析。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察 Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)：與NC組比較，DAI組大鼠第1～3天逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)；與DAI組比較，NM組大鼠第1～3天逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)；見表1?？臻g探索試驗(yàn)：三組大鼠2 min內(nèi)穿越平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.745，P=0.015)，其中，DAI組較NC組減少(6.58±3.20 vs.9.25±1.71)，而NM組多于DAI組(7.33±1.07 vs.6.58±3.20)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 NF-κB免疫組化結(jié)果 NC組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)可見彌散分布的NF-κB P65陽性細(xì)胞，為細(xì)小的棕褐色顆粒；DAI組可見NF-κB P65陽性細(xì)胞表達(dá)明顯增多；NM組NF-κB P65陽性細(xì)胞表達(dá)明顯減少。三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表2。

表1 各組逃避潛伏期比較(s)

注：*與DAI組比較，P<0.05

2.3 NF-κB Western blot結(jié)果 DAI組NF-κB 表達(dá)明顯高于NC組，NM組較DAI組表達(dá)明顯降低，但仍高于NC組(P<0.05)。見圖2。

圖1 大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)NF-κB 免疫反應(yīng)產(chǎn)物(×200)

組別只數(shù)NF?κB陽性細(xì)胞數(shù)NF?κB蛋白NC組423．08±4．23?35．41±3．87?DAI組433．75±3．6241．83±7．53NM組429．42±5．63?37．08±3．75?F值8．4804．653P值0．0010．017

注：*DAI組比較，P<0.05

圖2 各組大鼠海馬NF-κB表達(dá)

3 討論

DAI是顱腦外傷的常見伴發(fā)疾病，并且是顱腦損傷后重要的致殘?jiān)騕5]，神經(jīng)軸索的損傷及恢復(fù)在顱腦損傷后的功能康復(fù)中具有重要作用，目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確，且缺乏有效的治療措施。因此，從分子水平上探討DAI后相關(guān)病理生理改變，探討其可能的作用機(jī)制，對(duì)DAI的診治及改善預(yù)后有重要價(jià)值。

DAI后的神經(jīng)損傷不僅發(fā)生在損傷瞬間，且在其后的數(shù)小時(shí)或數(shù)天還可以出現(xiàn)神經(jīng)元延遲性死亡，導(dǎo)致長時(shí)間學(xué)習(xí)記憶障礙，影響認(rèn)知功能[6]，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。Ahman等[7]隨訪DAI患者發(fā)現(xiàn)，11年后，其仍存在學(xué)習(xí)記憶障礙。因此，長期的學(xué)習(xí)記憶障礙已成為顱腦損傷后DAI最顯著的后遺癥之一。本組實(shí)驗(yàn)中建立的DAI動(dòng)物模型具有顱腦損傷后DAI多項(xiàng)特征[8]，用于DAI的實(shí)驗(yàn)研究切實(shí)可行。本研究中，Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)及空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DAI組大鼠第1～3天逃避潛伏期較NC組延長，大鼠2 min內(nèi)穿越平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)明顯減少，提示DAI后可能造成時(shí)間、空間學(xué)習(xí)功能及記憶功能受損，出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙。

伴隨著DAI時(shí)神經(jīng)元軸索的斷裂、分解，神經(jīng)纖維損傷后發(fā)生生化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，髓鞘崩解產(chǎn)物激活炎性細(xì)胞，如TNF-α、IL-1等，在破壞-修復(fù)過程中會(huì)出現(xiàn)多種蛋白質(zhì)的變化，這與DAI的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在DAI的早期診斷、制定治療措施中十分重要[9-11]。在正常情況下，NF-κB存在于胞漿內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，NF-κB作為核轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族的主要成分被活化，并由胞質(zhì)移位至胞核，通過多種途徑參與免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活化過程中的基因表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著DAI后神經(jīng)纖維的破壞，軸索損傷的加重，髓鞘崩解產(chǎn)物的增多，NF-κB表達(dá)升高。提示NF-κB可能通過激活炎癥通路或啟動(dòng)某種級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與DAI的繼發(fā)性損傷,與錢偉等[12]報(bào)道顱腦損傷后NF-κB被激活并長時(shí)間活化，通過上調(diào)TNF-α的表達(dá)導(dǎo)致顱腦損傷加重相符。

NM作為選擇性二氫吡啶類鈣離子通道拮抗劑，通過選擇性地作用于腦血管平滑肌，抑制鈣離子內(nèi)流、減輕鈣超載；調(diào)節(jié)血管張力，擴(kuò)張腦血管，增加腦血流量，改善腦供血；減輕細(xì)胞毒性或血管源性腦水腫，減少神經(jīng)細(xì)胞的繼發(fā)性損傷，起到腦保護(hù)作用。本研究顯示，定位航行實(shí)驗(yàn)中，NM組大鼠第1～3天逃避潛伏期明顯縮短，空間探索實(shí)驗(yàn)中NM組大鼠2 min內(nèi)穿越平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)明顯增加，且與DAI組比較，NM干預(yù)后NF-κB蛋白表達(dá)明顯減低，提示NM可提高DAI大鼠的行為學(xué)評(píng)分，減輕DAI后的神經(jīng)功能障礙，提高DAI后的學(xué)習(xí)記憶功能，起到一定的神經(jīng)保護(hù)作用。該作用可能通過阻斷NF-κB通路啟動(dòng)的炎癥反應(yīng)，阻斷NF-κB的活化途徑，抑制NF-κB蛋白的活化來實(shí)現(xiàn)。本研究結(jié)果也為DAI后臨床盡早應(yīng)用腦保護(hù)劑(如NM)、有效改善預(yù)后、提高生活質(zhì)量提供了一定的理論依據(jù)。NM有望成為減輕DAI進(jìn)而減輕繼發(fā)性腦損傷的有效方法之一。

總之，探討DAI后認(rèn)知功能障礙的可能作用機(jī)制及其對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響，將有助于了解DAI的形成過程，以及在新的水平上尋找顱腦損傷后DAI的治療方案，以期尋求新的治療靶點(diǎn)。對(duì)DAI發(fā)病機(jī)制的深入研究，可能為減少DAI后神經(jīng)損傷、改善DAI后認(rèn)知功能提供新的途徑。

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Effect of nimodipine on learning and memory ability and expression of NF-κB in hippocampus of DAI rats

SHI Li-xin1a*,ZANG Ying-zhuo1b,HU Fu-guang2,WANG Qing-tao1c,MA Zhi-jun1d,ZHANG Wen-chao1a,WANG Chuan-hai1a

(1.a.Department of Neurosurgery,b.Department of Neurology,c.Department of Medical Imaging,d.Department of Anesthesiology,the People′s Hospital of Qinghe Country,Xingtai 054800,China;2.Department of Neurosurgery,the Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,China)

Objective To study the effects of nimodipine (NM) on learning and memory ability and the expression of NF-kappa B in hippocampus of rats with diffuse axonal injury (DAI),and discuss the neuroprotective mechanism of nimodipine.Methods Totally 36 rats were randomly divided into normal control group (NC group)，DAI group and NM group,12 rats in each group.The behaviors of rats were observed by navigation experiment and space exploration experiment through Morris water maze,and the expression of NF-κB were measured by using immunohistochemistry and Western blot method.Results The escape latency of DAI group was longer than that of NC group during first 3 days (P<0.05);at the same time,the escape latency of NM group was shorter than that of DAI group (P<0.05).The times of rats crossing the platform in DAI group were fewer than that of NC group within 2 min (P<0.05),while those of NM group were more than DAI group (P<0.05).The expression of NF-κB in hippocampus of DAI group was higher than that of NC group (P<0.05),while NM group was lower than DAI group (P<0.05).Conclusion The learning and memory ability of the DAI rats is impaired,the mainfestination includes prolonged escape latency and decreased times of platform crossing in Morris water maze test.The expression of NF-κB protein in rats increases after DAI,which may be related to axonal secondary injury.The neuroprotective effect of NM may be attributed to inhibiting the NF-κB protein expression.

Nimodipine;Diffuse axonal injury;Hippocampus;NF-κB

2016-06-04

1.河北省清河縣人民醫(yī)院a.神經(jīng)外科，b.神經(jīng)內(nèi)科，c.影像科，d.麻醉科，河北 邢臺(tái) 054800；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，石家莊 050000

邢臺(tái)市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2016ZC143)

10.14053/j.cnki.ppcr.201612002

*通信作者