仝偉建，祖新，段鵬，楊曉楠，李羽翡

（甘肅省食品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730030）

國(guó)標(biāo)法和紙片法做食品中菌落總數(shù)的對(duì)比

仝偉建，祖新，段鵬，楊曉楠，李羽翡

（甘肅省食品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730030）

目的：利用紙片法和國(guó)標(biāo)法同時(shí)測(cè)試食品中菌落總數(shù)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果來(lái)測(cè)試紙片法（非標(biāo)法）在檢測(cè)食品微生物菌落總數(shù)檢驗(yàn)中的準(zhǔn)確性。方法：用紙片法和國(guó)標(biāo)法（GB 4789.2-2010）在同一人員、相同的試驗(yàn)條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)所得的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，測(cè)試紙片法在菌落總數(shù)檢驗(yàn)中的準(zhǔn)確性。結(jié)果：紙片法所得的結(jié)果和國(guó)標(biāo)法結(jié)果對(duì)比顯示，對(duì)于污染嚴(yán)重的樣品，兩種方法具有顯著性的差異；對(duì)于相對(duì)潔凈的樣品，兩種方法的結(jié)果不具有顯著性差異。同時(shí)，紙片法所需的時(shí)間短，能有效地監(jiān)控食品被微生物污染的嚴(yán)重程度，但是在精確度上和國(guó)標(biāo)法還是有一定的差距。

國(guó)標(biāo)法和紙片法；食品微生物；檢驗(yàn)方法對(duì)比

隨著人們對(duì)食品安全性的重視，應(yīng)用到食品微生物的檢測(cè)手段也越來(lái)越多，諸多新型的微生物檢測(cè)技術(shù)如雨后春筍般涌出,給微生物檢測(cè)工作帶來(lái)了飛躍式的發(fā)展,使得食品衛(wèi)生檢驗(yàn)工作得到了良好的改善。如ATP生物發(fā)光技術(shù)[1]和全自動(dòng)微生物檢測(cè)法；在培養(yǎng)基中加入14C標(biāo)記的碳水化合物或鹽類的底物，測(cè)量細(xì)菌代謝后產(chǎn)生是否產(chǎn)生14CO2的放射測(cè)量法；以DNA作為細(xì)菌的遺傳分子，在微生物檢測(cè)方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，目前應(yīng)用較多的有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）[2]和具有多樣化、自動(dòng)化、微型化等特點(diǎn)的基因芯片技術(shù)[3]；利用微生物可以使電惰性底物（如碳水化合物、類脂、蛋白質(zhì)等）代謝成電活性產(chǎn)物（如乳酸鹽、醋酸鹽、氨等）的電阻抗檢測(cè)法[4]；以氣相色譜法、mini-VIDAS法以及Vietk-AMS法為主的儀器分析檢測(cè)的方法[5]；流式細(xì)胞術(shù)等。這些技術(shù)對(duì)檢驗(yàn)人員的素質(zhì)、檢驗(yàn)儀器、設(shè)備等要求較高，有些方法用在微生物檢驗(yàn)中還不太成熟[6]，目前最常用的還是形態(tài)學(xué)和生理生化的方法，但是這些方法操作繁瑣、所需時(shí)間長(zhǎng)、準(zhǔn)備工作和后期廢棄物處理工作繁重，且需大量的專業(yè)技術(shù)人員。而紙片法由于使用方便、操作簡(jiǎn)單，又能有效縮短檢驗(yàn)周期而被廣泛地應(yīng)用于監(jiān)控食品被微生物污染的程度。但是紙片法所得的結(jié)果究竟準(zhǔn)不準(zhǔn)確？它和國(guó)標(biāo)法所得的結(jié)果的差距又是多少？下面我們就來(lái)研究一下紙片法在食品菌落總數(shù)檢驗(yàn)中的準(zhǔn)確性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及儀器

平板計(jì)數(shù)瓊脂（北京陸橋，批號(hào)：150504）,菌落總數(shù)測(cè)試片（國(guó)產(chǎn)某廠家），恒溫恒濕培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)。

1.1.2 樣品

為確保試驗(yàn)結(jié)果的覆蓋性和準(zhǔn)確性，我們抽取容易受污染的食品（豆腐、肉）和相對(duì)較潔凈的食品（純凈水）各51個(gè)樣本。

1.2 方法

1.2.1 國(guó)標(biāo)法

按照國(guó)標(biāo)“菌落總數(shù)的測(cè)定”規(guī)定的方法進(jìn)行試驗(yàn)[7]。

（1）肉、豆腐樣品處理方法：稱取25 g樣品放入盛有225mL稀釋液的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2min，制成1∶10的樣品勻液。

（2）純凈水樣品處理方法：瓶口用酒精棉球消毒后，以無(wú)菌吸管吸取25 mL樣品置盛有225 m L磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1∶10的樣品勻液。

（3）用1mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1 m L，沿管壁緩慢注于盛有9 m L稀釋液的無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無(wú)菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1∶100的樣品勻液。

（4）按以上操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無(wú)菌吸管或加樣槍槍頭。

（5）根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10倍遞增稀釋時(shí)，吸取1 mL樣品勻液于無(wú)菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí)，分別吸取1 m L空白稀釋液加入兩個(gè)無(wú)菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。

（6）及時(shí)將15～20 mL冷卻至46℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于46℃±1℃恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。

（7）待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36℃±1℃培養(yǎng)48 h±2 h。

（8）如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長(zhǎng)的菌落時(shí)，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4 mL），凝固后翻轉(zhuǎn)平板，按（7）條件進(jìn)行培養(yǎng)。

（9）按照GB 4789.2-2010中6.3要求的方法對(duì)平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

（10）按照GB 4789.2-2010中7要求的方法進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。

1.2.2 紙片法

液體各取1m l，分別加入到2個(gè)測(cè)試片中；固體取25 g加入到225m l的0.85%的生理鹽水中，均質(zhì)2min（下一步驟同液體樣品）。36℃培養(yǎng)18～24 h。計(jì)數(shù)和結(jié)果計(jì)算均按照說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行。

2 結(jié)果

三種樣品不同檢驗(yàn)方法結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 三種樣品不同檢驗(yàn)方法結(jié)果

3 分析與討論

對(duì)于污染嚴(yán)重的樣品，結(jié)果通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算得出兩種方法具有顯著性差異，國(guó)標(biāo)法的結(jié)果要明顯高于紙片法；對(duì)相對(duì)潔凈的樣品，紙片法和國(guó)標(biāo)法的結(jié)果有非常好的相關(guān)性，兩者之間無(wú)顯著性差異；紙片法培養(yǎng)時(shí)間對(duì)結(jié)果有明顯影響。培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),紙片容易干，細(xì)菌較多的樣品菌落可能重疊在一起，對(duì)結(jié)果分析的準(zhǔn)確性有很大影響，個(gè)人認(rèn)為14 h～16 h是比較理想的培養(yǎng)時(shí)間。

GB 4789.2-2008中有紙片法測(cè)菌落總數(shù)的方法，但是到2010年標(biāo)準(zhǔn)更新了以后08版的菌落總數(shù)的測(cè)定方法就被取消了，然而GB 4789.2-2003的標(biāo)準(zhǔn)仍然沒(méi)有作廢，這也從另外一個(gè)角度說(shuō)明了紙片法具有一定的局限性。

紙片法和傳統(tǒng)的國(guó)標(biāo)法比較，省略了試驗(yàn)前期的準(zhǔn)備工作和后期的廢棄物處理工作，大大節(jié)約了工作時(shí)間和勞動(dòng)強(qiáng)度，并且在檢驗(yàn)流程、培養(yǎng)時(shí)間等環(huán)節(jié)都更為簡(jiǎn)便、快速[8]，用于測(cè)試相對(duì)潔凈的食品被細(xì)菌污染的程度還是值得使用的[9]。由于紙片檢測(cè)法，操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)較短，對(duì)于檢測(cè)潔凈度較高的食品無(wú)顯著差異，所以對(duì)于一些企業(yè)，在保證正常國(guó)標(biāo)法進(jìn)行出廠檢驗(yàn)的同時(shí)，可以將紙片法作為一種監(jiān)測(cè)手段。不僅可以對(duì)最終產(chǎn)品（成品）進(jìn)行檢測(cè)，也可對(duì)生產(chǎn)過(guò)程中各個(gè)階段的半成品進(jìn)行監(jiān)測(cè)，通過(guò)產(chǎn)品的出廠檢驗(yàn)與紙片法對(duì)生產(chǎn)產(chǎn)品的過(guò)程檢測(cè)相結(jié)合，對(duì)于保證生產(chǎn)各階段的質(zhì)量控制，提高最終產(chǎn)品的質(zhì)量，是大有裨益的。

［1］ 孫鳳霞.探析食品微生物檢驗(yàn)技術(shù)的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)醫(yī)藥指南,2014，12（23）：69-70.

［2］ 路則寶，白現(xiàn)廣.分子生物學(xué)技術(shù)中微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.紅河學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，11（2）：61-63.

［3］ 熊強(qiáng)，史純珍，劉釗.食品微生物快速檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展［J］.食品與機(jī)械，2009，17（5）：788-789.

［4］ 劉濱思.微生物檢驗(yàn)技術(shù)的研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2013，01（09）：38.

［5］ 王雪麗，蔡麗萍.微生物檢驗(yàn)技術(shù)研究的進(jìn)展［J］.化工管理，2015（13）：177.

［6］ 林蕾，張煒.食品微生物檢驗(yàn)技術(shù)的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，15（10）：97-99.

［7］ GB 4789.2-2010.食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

［8］ 李桂賢，張曉威，金晶.紙片法與平板傾注法檢測(cè)菌落總數(shù)試驗(yàn)報(bào)告［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，1991，1（2）：123.2.

［9］ 李洪，龔濤，達(dá)永淑，等.紙片探討影響大腸菌群快速紙片法的因素［J］.職業(yè)衛(wèi)生與病傷，2002，17（3）：198-199.

TS207

：A

DOI 10.3969/j.issn.1672-6375.2016.12.010

2016-9-21

仝偉建（1983-），男，漢族，山東金鄉(xiāng)人，研究生，中級(jí)獸醫(yī)師，主要從事食品微生物檢驗(yàn)工作。