張國改，曾平燕，肖雪蓉，馮毅凡，吳霞

(1.廣東藥科大學 中心實驗室，廣東 廣州 510006； 2.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣東 廣州 510530)

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知母醇提物對INS-1胰島β細胞功能的影響

張國改1，曾平燕2，肖雪蓉1，馮毅凡1，吳霞1

(1.廣東藥科大學 中心實驗室，廣東 廣州 510006； 2.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣東 廣州 510530)

目的 研究知母醇提物對正常和抵抗INS-1胰島β細胞的增殖及分泌功能的影響，探討知母醇提物對正常細胞的毒性影響以及對胰島素抵抗細胞的改善作用。方法 采用MTT法測定知母醇提物對正常INS-1胰島β細胞的增殖作用；知母醇提物干預(yù)正常細胞及胰島素抵抗INS-1胰島β細胞，分為溶媒組(ME)、胰島素分泌模型組(MC)、胰島素抵抗組(IR)、陽性藥格列本脲組(Gli)和羅格列酮組(ROZ)及知母醇提物組，測定各組基礎(chǔ)胰島素分泌(BIS)和葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)值。結(jié)果 知母醇提物質(zhì)量濃度在0.3～30 μg/mL時對正常細胞有明顯的增殖作用，與MC組的GSIS比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)；與IR組的BIS和GSIS比較，知母醇提物濃度在3～30 μg/mL能顯著促進細胞的BIS能力，同時其質(zhì)量濃度在0.3～30 μg/mL能顯著性促進GSIS功能。結(jié)論 知母醇提物在一定濃度范圍內(nèi)對正常INS-1胰島β細胞的毒性較低，同時能通過促進正常細胞的增殖，增強其胰島素分泌能力，改善細胞自身的胰島素抵抗。

知母醇提物； INS-1胰島β細胞； 增殖； 毒性

中藥知母(AnemarrhenaeRhizoma)為百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)的干燥根莖，現(xiàn)代藥理研究表明其具有改善記憶力[1]、抗氧化[2]、抗炎[3]、抗腫瘤[4]、降血糖[5]、降脂[6]等多種藥理活性。其主要的活性成分包括知母皂苷、雙苯吡酮和知母多糖等[7]。知母醇提物主要包括知母皂苷和雙苯吡酮。目前，國內(nèi)外大量文獻報道了知母可以促進胰島素分泌，改善胰島素抵抗(IR)，降低血糖以及維持血糖穩(wěn)定，用于治療2型糖尿病，并對糖尿病并發(fā)癥包括白內(nèi)障、血脂代謝紊亂等有防治作用[8]。

本實驗通過研究知母醇提物對正常INS-1胰島β細胞的增殖作用，以及胰島素的分泌功能，摸索給藥劑量，探討其對正常INS-1胰島β細胞的毒性影響及是否有增強細胞功能等作用；持續(xù)高糖刺激INS-1胰島胰島β細胞，使其出現(xiàn)IR現(xiàn)象，考察知母醇提物對IR的INS-1細胞的改善作用。

1 材料

1.1 儀器

倒置顯微鏡(江南顯微鏡有限公司)；BP210分析天平(Sartorius公司)；酶標儀(美國Bio-RAD)；-80 ℃超低溫冰箱(中科美菱公司)；KDC-220HR 高速冷凍離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)。

1.2 實驗藥材與試劑

知母藥材購自廣州致信藥業(yè)有限公司，由廣東藥科大學中藥學院劉基柱副教授鑒定為百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)的干燥根莖。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、丙酮酸鈉、β-巰基乙醇、0.05%胰酶-EDTA(Gibco)；HEPES(雷根生物)；DMSO(Sigma)；PBS緩沖溶液(Gibco)；MTT粉(廣州瑞舒生物科技有限公司)；格列苯脲、羅格列酮(左克齊云試劑)。

1.3 細胞

INS-1胰島β細胞株即大鼠胰島素瘤細胞株購自中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和細胞資源中心。

2 方法

2.1 溶液的配制

完全培養(yǎng)液：取5 mL 100×雙抗，50 mL FBS，500 μL HEPES溶液，500 μL 丙酮酸鈉溶液，50 μLβ-巰基乙醇，加到450 mL 基礎(chǔ)RPMI1640培養(yǎng)液中即可，4 ℃保存，2周有效。細胞凍存液：按照FBS∶DMSO=9∶1(體積比)配置，置于4 ℃預(yù)冷，現(xiàn)配現(xiàn)用。刺激INS-1胰島細胞分泌用葡萄糖母液：準確稱取1.68 g葡萄糖粉末，并溶于4 mL PBS，用0.22 μL微孔濾膜過濾并分裝，于-20 ℃保存即可。知母醇提物制備參考本實驗室課題組前期的研究[9]，稱取知母藥材300 g，粉碎，加入8倍量80%乙醇，加熱回流提取2次每次1 h，合并提取液，濃縮干燥即得。知母醇提物溶液：準確稱取1 mg 知母醇提物，加入適量的DMSO溶解提取物，配成0.1 mg/μL的母液，于-20 ℃保存。

2.2 MTT法測定INS-1胰島β細胞生長曲線

取生長狀態(tài)良好的INS-1胰島細胞，消化后計數(shù)，調(diào)整細胞密度至3×104個/ mL，接種于96孔板，設(shè)24、48、72、96、120 h這5個時間點，各設(shè)6個復(fù)孔及相應(yīng)空白對照。每個時間點取對應(yīng)孔板，小心棄上清后加入120 μL含MTT溶液的基礎(chǔ)培養(yǎng)液(1∶5),37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h,570 nm波長下測定吸光度A值，計算細胞生長曲線。

2.3 MTT法測定知母醇提物對正常INS-1胰島β細胞增殖的作用

實驗分為空白組(KB)、溶媒組(ME，內(nèi)含0.01%DMSO)、知母醇提物組(ZM)，其質(zhì)量濃度分別為0.3、3、30、60、80、200 μg/mL。取適量對數(shù)生長期的細胞，消化后計數(shù)，調(diào)整細胞密度至1×105個/mL，接種于96孔板，每組設(shè)置6個復(fù)孔，預(yù)培養(yǎng)24 h，分組給藥作用48 h后，小心吸棄上清培養(yǎng)液，MTT法，酶標儀570 nm波長下測定吸光度A值。以存活率表示INS-1胰島細胞的增殖程度：存活率=(實驗組A值-調(diào)零組A值)/(空白對照組A值-調(diào)零組A值)×100 %。

2.4 知母醇提物對正常INS-1胰島β細胞胰島素分泌的影響

實驗分為溶媒組(ME，內(nèi)含0.01%DMSO)、胰島素分泌模型組(MC，內(nèi)含0.01%DMSO+5.6 mmol/L或16.7 mmol/L葡萄糖)、陽性藥(格列苯脲)組(Gli，內(nèi)含0.15 μmol/L格列苯脲 + 5.6 mmol/L或16.7 mmol/L葡萄糖)、知母醇提物組(分別為30、3、0.3 μg/mL的知母醇提物+ 5.6 mmol/L或16.7 mmol/L葡萄糖)。取對數(shù)生長期的細胞，消化后計數(shù)，調(diào)整細胞密度至1×105個/mL，接種于48孔板，預(yù)培養(yǎng)24 h后，按分組給藥干預(yù)，藥物作用48 h后，小心吸棄上清培養(yǎng)液，PBS洗后加入300 μL/孔無糖培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中平衡30 min，基礎(chǔ)葡萄糖糖刺激組(BIS)，高糖刺激組(GSIS)分別給予5.6 mmol/L、16.7 mmol/L葡萄糖-無糖培養(yǎng)溶液，300 μL/孔；空白組給予相同體積無糖培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)1 h后，取上清液，-20 ℃保存待測胰島素量。

2.5 知母醇提物對IR的INS-1胰島β細胞分泌的影響

實驗分為胰島素分泌模型組(MC)：0.01%DMSO+5.6 mmol/L或16.7 mmol/葡萄糖；胰島素抵抗模型組(IR)：40 mmol/L葡萄糖+0.01%DMSO+5.6 mmol/L或16.7 mmol/L葡萄糖；陽性藥(羅格列酮)組(ROZ)：40 mmol/L葡萄糖+1.0 μmol/L羅格列酮+ 5.6 mmol/L或16.7 mmol/L葡萄糖；知母醇提物組：30、3、0.3 μg/mL知母醇提物+40 mmol/L葡萄糖+ 5.6 mmol/L或16.7 mmol/L葡萄糖。取對數(shù)生長期的細胞，消化后計數(shù)，調(diào)整細胞密度至1×105個/mL，接種于48孔板。預(yù)培養(yǎng)24 h后，小心吸棄上清培養(yǎng)液，按分組給藥干預(yù)。除胰島素分泌模型組外，其余各組加入含40 mmol/L葡萄糖的含藥培養(yǎng)基，干預(yù)48 h后，其余步驟同上。

2.6 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 正常INS-1胰島β細胞的形態(tài)特征

正常的INS-1細胞在顯微鏡下形態(tài)完整，折光性好，細胞膜邊緣有明亮的光環(huán)，胞質(zhì)內(nèi)含有較多黑色點狀胰島素分泌顆粒且呈聚集生長。見圖1。

a b

圖1 INS-1細胞在顯微鏡下的形態(tài)特征(a. 100×； b. 400×)

Figure 1 Morphology of INS-1 cells under the microscope (a. 100×; b. 400×)

3.2 INS-1胰島β細胞生長曲線

由圖2可見，INS-1細胞約24 h后開始進入對數(shù)生長期；48～72 h，細胞呈快速增長，處于對數(shù)增長期；72～120 h，細胞基本停止增長，進入平穩(wěn)期。

0.50.40.30.20.1A57024487296120144t/h

圖2 INS-1細胞的生長曲線

Figure 2 Growth curve of INS-1 cells

3.3 知母醇提物對正常INS-1胰島β細胞的增殖作用

從表1可見，知母醇提物在濃度范圍0.3～30 μg/mL時，對INS-1細胞有較為明顯的增殖作用(P<0.05或者P<0.01)。但是隨著給藥濃度的不斷增加，知母醇提物對INS-1的增殖作用呈現(xiàn)減弱的趨勢。

表1 知母醇提物對正常INS-1細胞的增殖作用

組別劑量/(μg·mL-1)存活率/%空白組-100溶媒組0.01%DMSO100.17±3.81知母醇提物組0.3106.86±5.40*3112.29±6.35**30108.80±5.24**60108.23±5.26**80105.51±3.53*20092.71±6.90*

與空白組比較：*P<0.05，**P<0.01。

3.4 知母醇提物對正常INS-1胰島β細胞胰島素釋放的影響

知母醇提物對正常 INS-1胰島β細胞的BIS、GSIS作用結(jié)果：(1)與模型組BIS比較，知母醇提物各個濃度均對INS-1細胞的BIS功能無明顯影響(P>0.05);(2)與模型組GSIS比較，知母醇提物給藥濃度為0.3、30 μg/mL時，顯著增強 INS-1細胞的GSIS功能(P<0.05)，而在給藥濃度為3 μg/mL時表現(xiàn)最為顯著(P<0.01)。見表2。

表2 知母醇提物對正常INS-1細胞胰島素釋放的影響

組別劑量/(μg·mL-1)ρ(胰島素)/(mU·L-1)BISGSIS溶媒組-7.05±0.837.05±0.83模型組-9.16±1.19**12.52±0.34**格列本脲組0.15μmol/L10.91±0.55##14.02±0.27△△知母醇提物組308.60±0.6013.55±0.64△310.19±0.9813.86±0.44△△0.39.22±1.1411.58±0.79△

與溶媒組比較：**P<0.01； 與模型組BIS值比較：##P<0.01； 與模型組GSIS值比較：△P<0.05，△△P<0.01。

3.5 知母醇提物對IR的INS-1胰島β細胞胰島素釋放的影響

知母醇提物對高糖誘導(dǎo)的IR的INS-1細胞的BIS、GSIS作用結(jié)果：(1)與IR模型組BIS比較，知母醇提物在給藥濃度為30、3 μg/mL時均能顯著促進IR的INS-1細胞的基礎(chǔ)分泌能力(P<0.05或P<0.01)；(2)與IR模型組GSIS比較，知母醇提物給藥濃度為30、0.3 μg/mL均能顯著促進IR的INS-1細胞的GSIS功能(P<0.01)。見表3。

表3 知母醇提物對IR的INS-1細胞胰島素釋放的影響

組別c(葡萄糖)/(mmol·L-1)干預(yù)劑量/(μg·mL-1)ρ(胰島素)/(mU·L-1)BISGSIS模型組--9.16±1.1912.52±0.34胰島素抵抗組40-9.48±0.6610.86±0.64**羅格列酮組401μmol/L11.45±1.21##12.27±0.46△△知母醇提物組403011.11±1.14#14.89±0.85△△40312.94±0.74##11.74±0.65400.310.36±0.7612.70±1.05△△

與模型組比較：**P<0.01； 與IR 的BIS值比較：#P<0.05，##P<0.01； 與IR 的GSIS值比較：△△P<0.01。

4 討論

4.1 知母醇提物對正常INS-1細胞增殖作用的評價

機體糖代謝異常及胰島素分泌紊亂與胰島β細胞數(shù)量的減少密切相關(guān)[10]。若藥物能夠促進胰島β細胞的增殖，即可直接增加細胞數(shù)量，間接增加胰島素分泌量，從而改善糖尿病的糖代謝異常及胰島素分泌紊亂。本實驗發(fā)現(xiàn)，在給藥濃度0.3～30 μg/mL時，知母醇提物能顯著促進INS-1胰島細胞的增殖，表明中藥知母對胰島β細胞增殖具有明顯的促進作用，有利于增加胰島素分泌細胞總量，提高胰島素的水平，從而對抗糖尿病時高糖環(huán)境對β細胞損傷。

IR作為2型糖尿病(T2DM)另一重要的發(fā)病機制，一直受到廣泛的關(guān)注。近來，研究人員發(fā)現(xiàn)IR不只發(fā)生在外周靶細胞上，胰島β細胞本身也有胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，也會發(fā)生IR[11]。因此，若能及早改善胰島β細胞IR，將有利于保護胰島β細胞功能，延緩T2DM的發(fā)生與發(fā)展。而T2DM的主要表現(xiàn)為BIS和GSIS能力下降，從實驗結(jié)果可知，高糖刺激下建立的INS-1細胞胰島素抵抗模型主要損害了細胞的GSIS能力，而知母醇提物在一定程度上能增強細胞的BIS和GSIS，減輕自身的IR。

4.2 知母醇提物對INS-1細胞的胰島素分泌作用評價

T2DM發(fā)病機理主要歸結(jié)為兩個方面：其一，胰島細胞損傷、功能異常，導(dǎo)致胰島素分泌缺陷。即機體長期高血糖使機體胰島素分泌障礙，加重了胰島細胞的負荷，最終導(dǎo)致胰島細胞的損傷，胰島素分泌功能異常；研究人員認為氧化應(yīng)激因子如高血糖、高血脂、肥胖等為T2DM高風險發(fā)病因子。因此，改善機體的氧化應(yīng)激狀態(tài)，減少甚至去除這些氧化應(yīng)激因子，對T2DM的治療具有非常重要意義；其二，IR指外周靶組織對胰島素的敏感性降低以及胰島β細胞自身過代償分泌胰島素導(dǎo)致胰島素分泌能力減弱。因此，如果能夠增強正常胰島β細胞的胰島素分泌，使其在高糖刺激下仍能穩(wěn)定分泌胰島素，將為T2DM的治療帶來新的契機。

現(xiàn)代藥理學研究證明，知母皂苷可以恢復(fù)機體胰島β細胞的功能，增強外周組織對胰島素的敏感性[12]，并可以通過抑制某些受體從而介導(dǎo)代謝通路來調(diào)節(jié)細胞增殖，減少T2DM并發(fā)癥[13]；雙苯吡酮類也被發(fā)現(xiàn)具有促進糖尿病大鼠能量代謝，降低IR，調(diào)節(jié)機體脂質(zhì)水平等作用[14-15]。根據(jù)實驗室前期研究結(jié)果顯示[9]，本實驗所用知母醇提物含有知母皂苷和雙苯吡酮兩大類藥效成分，與已有報道的相關(guān)研究文獻一致[7,9]。在給藥干預(yù)實驗研究中發(fā)現(xiàn)，知母醇提物可明顯促進正常INS-1細胞的增殖，并且對正常INS-1細胞和IR的INS-1細胞增強其釋放胰島素的作用，從而增強正常細胞的功能，當細胞遭遇高糖刺激時減少其產(chǎn)生IR的效應(yīng)，該實驗對研究增強胰島素細胞功能的藥物提供了一定的指導(dǎo)意義。

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(責任編輯：幸建華)

Effect of alcohol extract of Anemarrhenae Rhizoma on INS-1 islet β cells

ZHANG Guogai1,ZENG Pingyan2,XIAO Xuerong1,FENG Yifan1,WU Xia1

(1.CentralLaboratory,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.GuangzhouXiangxuePharmaceuticalCo.,LTD,Guangzhou510530,China)

Objective To study the effect of alcohol extract ofAnemarrhenaeRhizomaon the proliferation and secretary function of normal and resistant INS-1 islet β cells,and investigate the toxic effect of alcohol extract on normal INS-1 islet β cells and improvement effect of alcohol extract on the resistant INS-1 islet β cells. Methods The proliferation of normal INS-1 cells was measured by MTT assay. The normal cells and the insulin-resistant cells were treatment with alcohol extracts. The experiment was divided into different groups,including the vehicle group (ME),insulin secretion model group (MC),insulin resistance group (IR),positive drug glibenclamide urea (Gli) group and rosiglitazone (ROZ) group,and several concentrations of alcohol extract groups. The basal insulin secretion (BIS) and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) values were measured. Results Treatment with alcohol extract ofAnemarrhenaeRhizomaat 0.3～30 μg/mL contributed to the proliferation of normal cells. Compared with MC and alcohol extracts,the difference of GSIS was statistically significant (P<0.05 orP<0.01). Compared with IR,alcohol extracts increased the levels of BIS at 3-30 μg/mL and GSIS at 0.3-30 μg/mL. Conclusion The toxicity of alcohol extracts on normal islet beta cells is low in a certain concentration range. Alcohol extracts could promote the proliferation of normal cells and insulin secretion ability to improve insulin resistance of cells.

alcohol extract ofAnemarrhenaeRhizoma; INS-1 islet β cells; proliferation; toxic effect

2016-09-18

廣東省重大科技專項資金資助項目(2013A022100040)；廣東省醫(yī)學科學技術(shù)研究基金項目(A2015448)

張國改(1989—)，女，2014級碩士研究生，Email:zggcbl521@126.com；通信作者：馮毅凡(1963—)男，教授，主要從事現(xiàn)代儀器分析技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用與中藥分析與質(zhì)量控制，Email：yffeng@139.com；吳霞(1980—)，女，博士，副研究員，主要從事天然藥物活性成分和藥物分析研究，Email：wxiaxia@163.com。

時間：2016-11-29 11:27

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161129.1127.011.html

R285.5

A

1006-8783(2016)06-0762-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016091801