周永翠, 王廣歡
(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,廣東汕頭 515041; 2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院)
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新生大鼠NEC致腸管時(shí)序性病理變化
周永翠1, 王廣歡2
(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,廣東汕頭 515041; 2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院)
目的:探討壞死性小腸炎(necrotizing enterocolitis,NEC)腸管的病理變化以及凋亡因子Bax、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCAN)、血小板活化因子(platelet-activating factor,PAF)表達(dá)與時(shí)間的關(guān)系。方法:140只新生SD大鼠隨機(jī)分為NEC組和對(duì)照組。NEC組給予缺氧冷刺激加人工喂養(yǎng)。于建模后第1-7 d,每組每天處死10只,取結(jié)腸、回腸末段行病理學(xué)檢查。并根據(jù)組織學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)分為0-4分,評(píng)分>2為NEC。檢測(cè)回腸、結(jié)腸中PCNA、Bax、PAF的表達(dá)。結(jié)果:第1 d,腸管受損最嚴(yán)重,第3 d、第5 d損傷依次降低,第7 d器官的炎性改變基本吸收。Bax在腸管凋亡最重,有時(shí)間差異。PCNA在腸管增殖先弱后強(qiáng)。PAF在腸中增高。結(jié)論:NEC后會(huì)引起腸原發(fā)性損傷,且呈現(xiàn)不同的凋亡、增殖和炎性因子的變化,且損傷修復(fù)程度和時(shí)間各有不同,總體在建模后第4 d腸管修復(fù)起主導(dǎo)作用。
壞死性小腸結(jié)腸炎;血小板活化因子;增殖細(xì)胞核抗原
新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎是新生兒階段一種嚴(yán)重威脅患兒生命的胃腸道急癥,是新生兒中最常見(jiàn)、最具破壞性的疾病之一[1]。有關(guān)壞死性小腸炎(necrotizing enterocolitis,NEC)發(fā)病機(jī)理和特異性治療措施的研究己成為兒科學(xué)的重要課題。目前NEC的建模方法繁多,尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),本實(shí)驗(yàn)在以往NEC模型建立基礎(chǔ)上,力求選擇一種較理想科學(xué)的建模方法,為能更好的了解NEC的病因及發(fā)病機(jī)制,制定更有效的治療方法,提供模型基礎(chǔ)。
目前,對(duì)于NEC的研究多集中在病因和發(fā)病機(jī)制上,以及對(duì)于受傷腸管單個(gè)時(shí)刻的保護(hù)和預(yù)防方面,而對(duì)于NEC發(fā)生后腸管的時(shí)序性病理和功能變化,缺乏一個(gè)系統(tǒng)的研究和認(rèn)識(shí)。本文通過(guò)建立NEC動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)P?,研究NEC后新生大鼠的回腸、結(jié)腸病變過(guò)程,并檢測(cè)上述各器官中凋亡因子Bax、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCAN)、血小板活化因子(platelet-activating factor,PAF)的表達(dá),以期從炎癥損傷、凋亡、增殖3方面動(dòng)態(tài)了解NEC發(fā)生后腸管的病變過(guò)程,了解NEC后機(jī)體病理進(jìn)展以及轉(zhuǎn)歸的變化規(guī)律特點(diǎn)。
1.1NEC模型建立與分組 140只新生SD大鼠隨機(jī)分為NEC組和對(duì)照組,各70只。新生大鼠NEC模型的建立參照文獻(xiàn)[2],采用鼠代乳品人工喂養(yǎng)及缺氧冷刺激(100 %氮?dú)馊毖?0 s、4 ℃冷剌激l0 min,2次/d,連續(xù)3 d)的方法建立新生大鼠NEC模型。
1.2材料 分別于建模后第1-7 d,每組每天頸椎脫臼法處死10只,以止血鉗、手術(shù)剪刀剖腹,打開(kāi)腹腔分離胃腸道,觀察并記錄腸管顏色,有無(wú)出血,回腸膨脹、壞死及穿孔情況,并用數(shù)碼相機(jī)拍攝照片(MVC-FD91,Sony),各組大鼠均留取回盲部結(jié)腸、回腸標(biāo)本用于形態(tài)學(xué)觀察。
1.3病理切片制作及HE染色 生理鹽水沖洗后立即固定于10 %福爾馬林中48 h,石蠟包埋,常規(guī)制備4~6 μm組織切片并進(jìn)行HE染色。判定標(biāo)準(zhǔn):HE染色后在光鏡下觀察腸組織形態(tài)改變,根據(jù)腸組織固有層分離,中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),絨毛脫落,壞死,血管擴(kuò)張,間質(zhì)水腫,分為4級(jí)。每例新生鼠回盲部腸組織標(biāo)本觀察3個(gè)視野,取其平均值,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照Nadler EP報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)[3]。組織學(xué)評(píng)分≥2分確定為NEC。
1.4免疫組化學(xué)染色 檢測(cè)建模后1-7 d正常組和NEC組回腸和結(jié)腸中Bax、PCNA和PAF的表達(dá)。結(jié)果判定:光學(xué)顯微鏡下觀察著色反應(yīng),結(jié)果以細(xì)胞核或細(xì)胞漿有棕黃色顆粒沉著為陽(yáng)性結(jié)果。應(yīng)用Image-proplus 5.1圖像分析軟件進(jìn)行分析。
1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù),單因素方差分析(One-way ANONA),組間比較用LSD檢驗(yàn),方差不齊采用Dunnet’T3檢驗(yàn),計(jì)量資料用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1NEC致結(jié)腸、回腸損傷的病理改變 NEC組建模后第1 d見(jiàn)腸絨毛脫落、壞死致結(jié)構(gòu)消失,黏膜下及肌層水腫,腸壁淤血、出血、壞死伴大量炎細(xì)胞浸潤(rùn),以中性粒細(xì)胞為主,組織學(xué)評(píng)分多為3分和4分,至建模后第3~5 d時(shí)組織學(xué)評(píng)分多為2分,至建模后第7 d組織學(xué)評(píng)分多<1分。
2.2Bax在結(jié)腸、回腸中的表達(dá) Bax在腸絨毛上皮細(xì)胞表達(dá)。Bax在NEC組腸管中表達(dá)強(qiáng)于對(duì)照組。隨后逐漸下降,至第7 d時(shí)表達(dá)水平最低。定量分析結(jié)果,在NEC組的回腸和結(jié)腸中,Bax表達(dá)高于對(duì)照組,見(jiàn)圖1。
2.3PCNA在結(jié)腸、回腸中的表達(dá) PCNA表達(dá)在腸上皮細(xì)胞核中,PCNA在NEC組中建模后第1 d腸較正常降低。隨后逐漸增強(qiáng)至建模后第4、5 d。定量分析,在NEC組的腸管中PCNA表達(dá)低于正常對(duì)照組,見(jiàn)圖2。
2.4PAF在結(jié)腸、回腸中的表達(dá) PAF表達(dá)部位同Bax,PAF在NEC組第1 d腸較正常對(duì)照組增多,隨后逐漸增高至第4 d時(shí)開(kāi)始下降,第7 d時(shí)接近正常水平。定量分析結(jié)果,在NEC組,腸管中PAF表達(dá)高于正常對(duì)照組,見(jiàn)圖3。
3.1NEC模型建立及評(píng)價(jià) 近年來(lái)NEC的研究成為熱點(diǎn),動(dòng)物模型是研究其病因、機(jī)制及有效防治的基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)外關(guān)于NEC的建模方法很多,每種建模方法都有很多不同。大量研究證實(shí),NEC發(fā)病是多因素的,于是近年來(lái)研究人員開(kāi)始嘗試采用多因素聯(lián)合建立NEC動(dòng)物模型[4]。
本研究表明,應(yīng)用新生SD大鼠進(jìn)行缺氧、冷刺激及人工喂養(yǎng)操作能造成明顯病理改變的NEC模型,符合NEC的診斷標(biāo)準(zhǔn),且與人類新生兒NEC病理變化及臨床表現(xiàn)一致,顯示該 NEC動(dòng)物模型的方法成功,且具有科學(xué)性和合理性。
3.2NEC模型中腸時(shí)序性病理?yè)p傷以及凋亡、增殖和炎性因子變化及意義 NEC后腸管的損傷和炎性反應(yīng)以及損傷后修復(fù)等的病理變化均伴隨了細(xì)胞增殖、凋亡和炎性因子的改變。
雖然末期NEC組織病理學(xué)表現(xiàn)為典型腸組織廣泛壞死,但在疾病初期,凋亡可能是NEC腸上皮細(xì)胞死亡的主要方式[5]。目前,炎性反應(yīng)相關(guān)的多臟器功能失常綜合征的凋亡相關(guān)基因中Bax研究較多。表明NEC后各器官均引起細(xì)胞凋亡的增加,特別是受損最重的腸管,自身反應(yīng)不同,出現(xiàn)下降的到穩(wěn)定的時(shí)間的先后。
PCNA被廣泛應(yīng)用于研究細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)。本研究表明,NEC時(shí)腸上皮細(xì)胞增殖減少,腸道損傷后修復(fù)功能降低。在小腸缺血再灌注損傷時(shí),PCNA的表達(dá)變化與腸道上皮細(xì)胞增殖分化相一致,可能與損傷后的腸黏膜自身修復(fù)相關(guān)[6]。另外,本研究表明在建模后第4 d后腸管的損傷才處于正性修復(fù)階段。
近年來(lái),研究證實(shí)PAF在NEC的炎癥連鎖反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。結(jié)果表明,NEC后包括腸道損傷后,由致炎物質(zhì)進(jìn)一步激活,在上皮、腺體和炎細(xì)胞合成大量的PAF,形成惡性循環(huán),故NEC后腸中 PAF表達(dá)較正常增高[7]。另外,不同器官中回腸PAFR基因轉(zhuǎn)錄不同,以回腸最高。提示PAF在不同的部位其合成的組織和細(xì)胞也不全相同,其具體機(jī)理有待進(jìn)一步的研究。
總之,NEC后會(huì)引起腸原發(fā)性損傷,且呈現(xiàn)不同的凋亡、增殖和炎性因子的變化,且損傷修復(fù)程度和時(shí)間各有不同,總體在建模后第4 d器官修復(fù)起主導(dǎo)作用。
[1] 曾振華.新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)探究[J].中外醫(yī)學(xué)研究,2014,12(27):152-153.
[2] 劉斌,閻靜江,李曉霞.新生鼠壞死性小腸結(jié)腸炎動(dòng)物模型建立方法改進(jìn)[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生 2015,53(35):22-25.
[3] Nadler EP,Upperman JS,Ford HR.Controversies in the management of necrotizing enterocolitis.[J].Surgical Infections,2001,2(2):119-120.
[4] 鄭曉輝,周偉.壞死性小腸結(jié)腸炎動(dòng)物模型簡(jiǎn)介及評(píng)價(jià)[J].中國(guó)新生兒科雜志,2010,25(2):116-118.
[5] 劉健,陳競(jìng)芳,卓玲,等.腸細(xì)胞凋亡在新生鼠壞死性小腸結(jié)腸炎腸損傷中動(dòng)態(tài)變化[J].中國(guó)新生兒科雜志,2008,23(6):349-352.
[6] 王運(yùn)星,吳承堂,殷剛,等.小腸缺血再灌注損傷時(shí)腸道上皮細(xì)胞PCNA的表達(dá)[J].中國(guó)普通外科雜志,2009,18(4):409-411.
[7] 陳霞,吳有良,陳曉熹.煙酰胺對(duì)大鼠壞死性小腸結(jié)腸炎模型的保護(hù)作用[J].中國(guó)新生兒科雜志,2015,30(4):294-297.
Sequential pathological changes of intestine tubes induced by NEC in neonatal rats
ZHOU Yongcui1,WANG Guanghuan2
(1.TheFirstAffiliatedHospitalofShantouMedicalCollege515041,China;2.TheSecondAffiliatedHospitalofShantouMedicalCollege)
Objective:To explore the pathological changes of intestine tubes induced by necrotizing enterocolitis (NEC) and the relationship between expression and time of the apoptosis factor Bax, proliferating cell nuclear antigen(PCAN) and platelet-activating factor (RAF). Methods:140 neonatal Sprague-Dawley rats were randomly divided into Group NEC and the contrast group. NEC models were established by artificial feeding, hypoxia and cold stimulation. 10 rats were killed in each group from the 1st day to the 7th day after modeling and the terminal ileum, colon were selected for pathological examination. The scores ranged from 0 to 4 based on the histological diagnostic criterion. The score >2 indicated NEC. The expression levels of Bax, PCNA and PAF in the ileum and the colon were determined. Results:The damage to the bowel was the most serious on the first day. On the third day, the score of intestine injury in rats was significantly lower than that on the first day. On the fifth day, the organ damage was significantly reduced compared to that on the third day. Inflammatory changes of the organs were almost absorbed on the 7th day. There was difference in terms of the time of apoptosis factor Bax, which was damaged the most seriously in intestine tubes. In the intestine, the proliferation was from weak to strong ; the expression of PAF was increased. Conclusions:NEC can lead to different degrees of primary injury of intestines, apoptosis, proliferation, and the degree and time of injury and repair are different. In general, instestinal repair plays a leading role on the 4th day after modeling.
Necrotizing enterocolitis; Platelet activating factor; Proliferating cell nuclear antigen
王廣歡
2016-06-15)