袁睿 劉蓮 馬建軍 張力 劉紅蕓

CIK免疫療法治療HBV攜帶者療效觀察

袁睿 劉蓮 馬建軍 張力 劉紅蕓

目的 觀察針對HBV攜帶者，采用CIK免疫療法進(jìn)行治療產(chǎn)生的臨床療效。方法選取60例HBV攜帶者，隨機(jī)分為兩組，治療組與對照組各30例；給予對照組常規(guī)保肝治療，治療組則采取常規(guī)保肝治療+CIK免疫療法，對HBV攜帶者進(jìn)行治療；觀察不良反應(yīng)情況，并分別于治療前后比較兩組免疫反應(yīng)、細(xì)胞因子變化情況。結(jié)果治療組出現(xiàn)不良反應(yīng)2例，概率6.67%；治療前HBV-DNA載量、HBV-DNA陰轉(zhuǎn)情況，2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，治療6個月后，HBV-DNA載量下降≥2個log值，共10例，有效率為33.3%，HBV-DNA陰轉(zhuǎn)共6例，有效率為20%；對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；比較治療前后細(xì)胞因子變化，對照組于治療前后無差異(P>0.05)，治療組IL-2、IFN-γ升高，IL-4、IL-10水平均降低，IFN-γ/IL-10升高，均存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；對照組于治療組組間依次比較，治療后指標(biāo)均出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。結(jié)論CIK免疫療法治療HBV攜帶者，可有效改善Th1/Th2細(xì)胞功能，促進(jìn)HBV-DNA陰轉(zhuǎn)，對治療HBV具有重要作用，值得臨床推廣。

CIK；HBV攜帶者；HBV-DNA陰轉(zhuǎn)；細(xì)胞因子

HBV乙型肝炎病毒為嗜肝DNA病毒，乙肝病毒在肝臟內(nèi)繁殖和復(fù)制，但是對肝細(xì)胞沒有明顯的直接損傷，其引起慢性乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，可能與機(jī)體的免疫應(yīng)答等有關(guān)。免疫耐受期和非活動型攜帶者的HBV感染者沒有臨床癥狀且肝功能正常[1]。由于HBV感染患者的自身免疫狀態(tài)不同、被感染方式不同。且患者的病毒復(fù)制情況不同，患者發(fā)生肝外感染疾病情況有一定差異，導(dǎo)致慢性HBV攜帶者會出現(xiàn)不同情況的肝組織病變，病理有一定差異，甚至可直接發(fā)展為肝硬化或肝癌[2]，所以他們也需要臨床早期干預(yù)。本研究中通過觀察CIK免疫療法治療前后的外周血Th1相關(guān)因子白細(xì)胞介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)和Th2相關(guān)因子白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)的濃度來了解Th1/Th2細(xì)胞功能，從而闡明免疫耐受在HBV攜帶者疾病進(jìn)程中的作用機(jī)制，尋求打破免疫耐受可能的免疫治療方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2013年1月至2013年11月門診及住院治療的患者共60例，所有患者診斷均符合2010年慢性乙型肝炎防治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，且無甲型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎及戊型肝炎等重疊感染，無酒精及藥物導(dǎo)致的肝臟損傷。納入患者既往無抗病毒藥物治療病史和免疫調(diào)節(jié)藥物治療病史，并均知情同意，簽署同意書。對患者隨機(jī)分為治療組及對照組，治療組30例，男16例,女14例；年齡19～57歲,平均(37.4±2.6)歲；對照組30例，男15例,女15例，年齡20～54歲,平均(35.8±2.4)歲。2組臨床資料，其性別比、年齡，以及病毒學(xué)指標(biāo)等相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法 2組HBV攜帶者均給予常規(guī)的保肝等治療，而治療組則在對照組治療的基礎(chǔ)上，另為患者給予CIK免疫療法，留取患者血清，使用ELISA法檢測細(xì)胞因子IL-2、IFN-r、IL-4、IL-10，對治療組進(jìn)行CIK治療。

1.2.1 CIK細(xì)胞體外擴(kuò)增：所有治療組患者在治療前均進(jìn)行采血。使用血細(xì)胞分離機(jī)封閉式掛到對單個核心給予采集，在無血清培養(yǎng)基AIMV將細(xì)胞數(shù)量調(diào)整為1×106個/ml，治療首日加入rhIFN-γ 106U/L，在培養(yǎng)1d后加入rhlL-2(劑量為3×105U/L)，rhIL-1 (劑量為3×105U/L)及OKT(劑量為350 μg/L)進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)。每四天更換一次培養(yǎng)基，將細(xì)胞數(shù)量調(diào)整為1×109個/L，隨后再補(bǔ)加rhlL-2，劑量為3×105U/L。隨后每8 h再補(bǔ)加rhIL-2及OKT 350 μg/L。2周后對CIK細(xì)胞進(jìn)行收集，使用0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行3次洗滌，并加入人血白蛋白。使用0.9%氯化鈉溶液配成100 ml細(xì)胞懸液，并進(jìn)行靜脈回輸，每日輸入1次，共輸入3 d，每次細(xì)胞數(shù)量為2×106～6×106個。在回輸前要確保支原體檢測、細(xì)菌檢測及病毒檢測均呈現(xiàn)陰性。

1.2.2 儀器與主要試劑：Human THl/TH2 Cytokine Kit(BD公司)；無血培養(yǎng)基(AIMV)(G1BCO提供)；Forma311型C0：培養(yǎng)箱，F(xiàn)ormal205生物安全柜。XL型流式細(xì)胞儀為COUL—TER公司生產(chǎn)，血細(xì)胞分離儀(CS-3000PLUS)。

1.3 觀察指標(biāo) 對患者輸液期間不良反應(yīng)進(jìn)行觀察和統(tǒng)計，利用WH0統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)給予評價毒性[4]。對患者給予治療前治療后免疫指標(biāo)進(jìn)行測定，方法為流式細(xì)胞儀檢測，其中Th1細(xì)胞選擇IL-2和IFN-γ因子，Th2細(xì)胞選擇IL-4和IL-10作為代表，并檢測健康者的免疫指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察 CIK細(xì)胞回輸后，治療組食欲、精神、較前改善者共28例，僅2例患者在回輸時發(fā)生了不良反應(yīng)(占6.67%)，表現(xiàn)為面部潮紅伴輕微煩躁感，患者均無發(fā)熱、皮疹等不良反應(yīng)；所有患者回輸后均給予血常規(guī)、肝腎功能的測定，均較治療前無明顯改變。

2.2 2組免疫反應(yīng)對比 治療前，2組HBV-DNA載量、HBV-DNA陰轉(zhuǎn)情況比較，組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；治療后6個月，治療組30例患者經(jīng)CIK免疫治療，10例患者HBV-DNA較治療前下降大于等于2個

log值，顯效率為20%，有效率為33.3%；2組HBV-DNA載量比較，于治療后6個月，治療組改善顯著，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療組有6例患者出現(xiàn)HBV-DNA陰轉(zhuǎn)，有效率為20%；對照組無陰轉(zhuǎn)，有效率為0，統(tǒng)計學(xué)差異顯著(P<0.01)。見表1。

組別HBV-DNA載量(log)治療前治療后HBV-DNA陰轉(zhuǎn)[例(%)]治療前治療后治療組7.42±0.674.32±0.64*06(20.0)*對照組7.39±0.717.36±0.5800t值0.4759.3840.00027.358P值>0.05<0.05>0.05<0.01

注：與治療前比較，*P<0.05

2.3 治療前后細(xì)胞因子的變化 治療組：IL-2和IFN-r較治療前升高，IL-4和IL-10水平均較治療前降低，IFN-γ/IL-10較治療前升高，各指標(biāo)較治療前存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對照組，以上4項指標(biāo)治療后與治療前無顯著差異(P>0.05)；2組依次比較，治療前指標(biāo)無差異(P>0.05)，治療后指標(biāo)均出現(xiàn)顯著差異，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

組別IL-2治療前治療后IFN-γ治療前治療后IL-4治療前治療后IL-10治療前治療后治療組119.64±52.71181.23±73.87*16.07±10.4729.07±14.38*97.54±44.7351.72±38.47*37.25±11.5418.27±7.84*對照組118.81±53.45121.49±60.7315.73±9.8716.76±11.7298.17±43.8796.54±41.8637.34±10.9735.41±9.93t值0.01514.3580.27216.2460.13516.5741.02413.257P值>0.05<0.01>0.05<0.01>0.05<0.01>0.05<0.01

注：與治療前比較，*P<0.05

3 討論

CD4+Th細(xì)胞按照所產(chǎn)生細(xì)胞因子的不同，包括有Th1和Th2[5]。其中Th1型細(xì)胞主要介導(dǎo)人體內(nèi)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，且會產(chǎn)生IFN-γ、IL-2、IFN-α等；而Th2型細(xì)胞則可以促進(jìn)人體內(nèi)的抗體的產(chǎn)生，并會有效地介導(dǎo)體內(nèi)的體液免疫應(yīng)答反應(yīng)，產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等。臨床大量研究顯示[6]， IFN-γ和IL-2為Th1型細(xì)胞因子代表， IL-4、IL-10則為Th2型細(xì)胞因子的代表。因此當(dāng)患者體內(nèi)出現(xiàn)有Th1/Th2的失衡，可以利用IL-4、IL-10、IFN-γ和IL-2等進(jìn)行表示。

目前臨床研究認(rèn)為，慢性乙型肝炎患者伴有Th2細(xì)胞所介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)，并以其為主導(dǎo)作用，而IFN-γ則可以對乙型肝炎病毒感染產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)。乙型肝炎病毒在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄后，其水平會受到抑制，而IFN-γ結(jié)合可以與細(xì)胞受體相結(jié)合，并進(jìn)一步產(chǎn)生抗病毒蛋白。在Th1型細(xì)胞中，隨著Th2細(xì)胞合成的增加，會受到一定的限制，并導(dǎo)致IFN-γ對乙型肝炎病毒的殺滅作用減弱，使人體對病毒的抑制作用降低，乙型肝炎病毒持續(xù)復(fù)制，導(dǎo)致慢性病的發(fā)生。

此外臨床研究還顯示出[7,8]，慢性乙型肝炎患者Th1細(xì)胞因子中的IFN-γ一般檢測結(jié)果較低，提示我們患者的細(xì)胞免疫低下，且不能有效地對體內(nèi)乙肝病毒進(jìn)行清除。而IL-10則主要為單核細(xì)胞產(chǎn)生，可以對Th1細(xì)胞形成抑制作用，且IL-10還可以參與到乙肝免疫應(yīng)答及肝臟炎性反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，在慢性乙型肝炎患者中，IL-10與乙型肝炎DNA水平和ALT水平均有明顯的相關(guān)性。從研究結(jié)果還顯示出，治療組進(jìn)行CIK免疫治療后能夠有效地提高患者血清IFN-γ，并降低IL-10水平和升高IFN-γ/IL-10，并且治療組在治療后與治療前有明顯差異[9]。

在本研究中，通過CIK細(xì)胞體外擴(kuò)增體外后回輸，增強(qiáng)患者的免疫應(yīng)答能力，抑制乙肝病毒在體內(nèi)的復(fù)制。結(jié)果顯示，治療組30例患者經(jīng)CIK免疫治療，10例患者HBV-DNA較治療前下降大于等于2個log值，顯效率為20%，有效率為33.3%；2組HBV-DNA載量比較，于治療后6個月，治療組改善顯著，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療組有6例患者出現(xiàn)HBV-DNA陰轉(zhuǎn)，有效率為20%；對照組無陰轉(zhuǎn)，有效率為0，統(tǒng)計學(xué)差異顯著(P<0.01)。治療組：IL-2和IFN-γ較治療前升高，IL-4和IL-10水平均較治療前降低，IFN-γ/IL-10較治療前升高，各指標(biāo)較治療前存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步說明了通過CIK免疫療法對HBV攜帶者有較好的治療效果，可以提高臨床治療效果。

1 中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會,中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會.慢性乙型肝炎防治指南2010年版更新版.中華實驗和臨床感染病雜志:電子版,2011,5:50-60.

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10.3969/j.issn.1002-7386.2016.24.025

050031 河北省石家莊市裕強(qiáng)街道辦事處社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心(袁睿、劉紅蕓)；河北省石家莊市第五醫(yī)院(劉蓮、馬建軍)；河北省趙縣人民醫(yī)院(張力)

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A

1002-7386(2016)24-3771-03

2016-07-02)