杜樂(lè)妍，王海烽，時(shí) 曉，趙寶華，何宏軒*

(1.河北師范大學(xué)，河北石家莊 050024；2.北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心，北京 102100；3.中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所，北京 100101)

眼鏡蛇中間克呂沃菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

杜樂(lè)妍1,3，王海烽3，時(shí) 曉2，趙寶華1*，何宏軒3*

(1.河北師范大學(xué)，河北石家莊 050024；2.北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心，北京 102100；3.中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所，北京 100101)

為了研究北京市昌平區(qū)蛇場(chǎng)眼鏡蛇的死亡原因，對(duì)眼鏡蛇進(jìn)行剖檢、病理組織觀察、病原菌的分離培養(yǎng)、生化鑒定、16 S rRNA PCR以及致病力試驗(yàn)，確定致病菌為中間克呂沃菌。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌對(duì)阿米卡星、慶大霉素、亞胺培南、美洛培南、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、氨曲南、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦、左氧沙星高度敏感，對(duì)氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、復(fù)方新諾明、氯霉素、四環(huán)素、哌拉西林耐藥。試驗(yàn)結(jié)果可為眼鏡蛇感染中間克呂沃菌的治療提供依據(jù)。

眼鏡蛇；中間克呂沃菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

中間克呂沃菌為革蘭陰性菌，屬于腸桿菌科、克呂沃菌屬[1]。1981年Farme等正式確立克呂沃菌屬，包括抗壞血酸克呂沃菌(Kluyveraascorbata)、棲冷克呂沃菌(Kluyveracryocrescens)和克呂沃菌種群3(Kluyveraspp)[2]，中間克呂沃菌屬于克呂沃菌屬種群3[3]。19世紀(jì)80年代早期，克呂沃菌被認(rèn)為是人體內(nèi)的正常菌群之一，不具有致病性[2]。然而，近年來(lái)關(guān)于克呂沃菌感染的病例越來(lái)越多，包括胃腸道感染[4-5]、尿路感染[6-7]、軟組織感染[8-9]等，甚至敗血癥[10]以及其他的嚴(yán)重感染[1，7]。目前，已報(bào)道的感染案例主要以人為主，未見(jiàn)蛇感染該菌的報(bào)道。2014年10月，北京市昌平區(qū)蛇場(chǎng)眼鏡蛇出現(xiàn)腹瀉、行動(dòng)遲緩、停食、消瘦以及死亡情況。通過(guò)對(duì)患病眼鏡蛇進(jìn)行病原菌的分離鑒定以及致病力試驗(yàn)，確定導(dǎo)致眼鏡蛇死亡的致病菌，進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，從而指導(dǎo)蛇場(chǎng)用藥。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 5條患病眼鏡蛇均來(lái)自北京市昌平區(qū)蛇場(chǎng)，其中1條已死亡；SD大鼠，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.1.2 主要試劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；2×TaqPCR Master Mix，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；BD革蘭陰性/陽(yáng)性細(xì)菌鑒定/藥敏板，上海碧迪醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片，北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 患病眼鏡蛇的剖檢及病理組織觀察 對(duì)患病眼鏡蛇進(jìn)行剖檢，觀察并記錄其內(nèi)臟器官的病理變化。用100 mL/L福爾馬林對(duì)患病眼鏡蛇心臟、肝臟、腎臟等組織固定，制作病理切片觀察。

1.2.2 病原菌的分離培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)觀察 無(wú)菌條件下，取患病眼鏡蛇的咽拭、肛拭、心臟、肝臟、腎臟、肺組織接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37℃恒溫培養(yǎng)18 h。對(duì)優(yōu)勢(shì)菌的單菌落劃線培養(yǎng)，進(jìn)行純化，觀察其形態(tài)，并進(jìn)行革蘭染色。

1.2.3 病原菌的生化鑒定 將病原菌的純培養(yǎng)菌液稀釋至麥?zhǔn)蠞舛?.5～0.6，使用BD PhoenixTM-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀，對(duì)分離菌進(jìn)行生理生化鑒定。

1.2.4 病原菌的16 S rRNA鑒定 以純化后的單菌落為模版，進(jìn)行細(xì)菌16 S rRNA擴(kuò)增，引物序列：27F：5′ -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，PCR純化產(chǎn)物送北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對(duì)。將得到的序列用MEGA6進(jìn)行分析，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.2.5 病原菌藥敏試驗(yàn) 使用Kirby-Bauer法[11]，稀釋菌液至麥?zhǔn)蠞舛?.5，在MH平板均勻涂布，貼上19種藥敏片，每塊平板5片，37℃培養(yǎng)24 h，參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)藥敏標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。

1.2.6 SD大鼠致病力試驗(yàn) 將病原菌培養(yǎng)16 h后，調(diào)整菌液濃度至1.5×109CFU/mL。取SD大鼠6只，隨機(jī)分成2組，其中試驗(yàn)組5只，對(duì)照組1只，試驗(yàn)組采取腹腔注射的方法進(jìn)行攻毒，攻毒劑量為0.2 mL/10 g體重，對(duì)照組采取相同的方法注射同等劑量的滅菌生理鹽水[12-13]。試驗(yàn)組和對(duì)照組分開(kāi)飼養(yǎng)，觀察記錄大鼠的發(fā)病情況。

2 結(jié)果

2.1 患病眼鏡蛇的病理變化

對(duì)患病眼鏡蛇進(jìn)行剖檢，發(fā)現(xiàn)其肺部和心臟腫大，肝臟、肺、腎臟均出現(xiàn)不同程度的出血(圖1A、圖1B)，其中肝臟病變最嚴(yán)重，同時(shí)，腸道、肺、腎臟、食管均有不同程度的出血或纖維素性滲出(圖1C、圖1D)。觀察病理組織切片發(fā)現(xiàn)心肌增生，纖維蛋白滲出(圖2A)，肺出血、水腫，肺泡壁增厚(圖2B)，肝臟組織出現(xiàn)顆粒性壞死，淋巴細(xì)胞增加(圖2C)。

A,D.肝臟；B,C.肺臟

A,D.Liver；B,C.Lung

圖1 剖檢病理變化

Fig.1 Pathological lesions in autopsy

A.心臟(600×)；B.肺臟(600×)；C.肝臟(600×)

A.Heart(600×); B.Lung(600×);C.Liver(600×)

圖2 眼鏡蛇病理組織切片圖

Fig.2 Histopathological slice observation in cobra

2.2 病原菌的分離培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)觀察

分離得到1株優(yōu)勢(shì)菌株，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上為圓形、半透明、表面光滑的菌落。進(jìn)行革蘭染色，鏡檢結(jié)果為革蘭陰性桿菌。

2.3 病原菌生化鑒定結(jié)果

使用BD PhoenixTM-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行鑒定，可信度高于90%，給出結(jié)果(表1)。與BD鑒定儀細(xì)菌庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)菌株的生化鑒定結(jié)果相比，分離菌只有精氨酸-精氨酸-AMC、L-亮氨酸-AMC這兩項(xiàng)結(jié)果不符。BD PhoenixTM-100細(xì)菌鑒定儀結(jié)果顯示該菌為中間克呂沃菌的可信度為99%，可初步可將病原菌鑒定為中間克呂沃菌。

表1 病原菌的生化鑒定

Table 1 The biochemical identification of the pathogenic bacteria

項(xiàng)目Item分離菌Isolatedbacteria標(biāo)準(zhǔn)菌Standardbacteria精氨酸-精氨酸-AMCARARR-+苷氨酸-AMCGLYB-VL-精氨酸-AMCLARGH-VL-亮氨酸-AMCLLEUH-+L-脯氨酸-AMCLPROB--L-色氨酸-AMCLTRY--乙酸ACT-V檸檬酸鹽CIT-VD-甘露醇DMNT+V丙二酸MLO-V順芷酸TIG--GAMMA-L-谷氨酰-NALGGH--PNP-BD葡糖苷BDGLU++BETA-阿洛糖BALL-VDEDXTROSEDEX++D-半乳糖DGAL++D-蜜二糖DMLB++蔗糖DSUC-VL-阿拉伯糖LARA+V甲基-B-葡糖苷MBGU+VN-乙酰-氨基半乳糖NGA--鳥(niǎo)氨酸ORN+V七葉酸ESC++苷氨酸-脯氨酸-AMCGLPRB--戊二酰-苷氨酸-精氨酸-AMCGUGAH--L-谷氨酸-AMCLGTA-VL-苯丙氨酸-AMCLPHET--L-焦谷氨酸-AMCLPYR--賴氨酸-丙氨酸-AMCLYALD-V福壽草醇ADO--多黏菌素ECLST--ALPHA-酮戊二酸KGA-V多黏菌素BPXB--U-N-乙酰-BD-氨基葡糖NAG--賴氨酸-丙氨酸-AMCLYALD-VBIS(PNP)磷酸鹽BPHO++BETA-龍膽二糖BGEN++D-果糖DFRU++D-葡糖酸DGUA++山梨醇DSBT--半乳糖醛酸GRA+VL-鼠李糖LRHA++麥芽酮糖MTU++N-乙酰-葡糖胺NGU++尿素URE--

注：“+”為陽(yáng)性反應(yīng);“-”為陰性反應(yīng);“V”為可疑。

Note："+" Positive;"-" Negative; "V" Ariable.

2.4 病原菌的16 S rRNA鑒定結(jié)果

病原菌的16 S rRNA基因PCR擴(kuò)增凝膠電泳顯示該菌擴(kuò)增的基因片段約為1 466 bp左右(圖3)。將測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與GenBank登錄的多株中間克呂沃菌(KM222638,KT767953,KT767943,KT767942,KT767802)同源性均為99%，說(shuō)明該菌為中間克呂沃菌。使用MEGA 6制作16 S rRNA基因序列進(jìn)化樹(shù)(圖4)，表明分離菌(Kluyveraintermedia cobra)與中間克呂沃菌親緣關(guān)系最近，處于同一進(jìn)化枝上。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1.病原菌16 S rRNA PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000;1.PCR products of 16 S rRNA of bacteria

圖3 病原菌16 S rRNA PCR擴(kuò)增電泳圖

Fig.3 Electrophoresis of PCR products of 16 S rRNA of bacteria

圖4 16 S rRNA基因序列進(jìn)化樹(shù)

2.5 病原菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

分離的病原菌對(duì)阿米卡星、慶大霉素、亞胺培南、美洛培南、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、氨曲南、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦、左氧沙星高度敏感；對(duì)頭孢唑林、環(huán)丙沙星中度敏感；對(duì)氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、復(fù)方新諾明、氯霉素、四環(huán)素、哌拉西林耐藥(表2)。

2.6 SD大鼠致病力試驗(yàn)

試驗(yàn)組大鼠接種菌液29 h后，表現(xiàn)為精神委靡，行動(dòng)遲緩，食欲不振，呈腹式呼吸。接種36 h內(nèi)，試驗(yàn)組大鼠全部死亡，對(duì)照組大鼠正常。對(duì)死亡大鼠進(jìn)行剖檢發(fā)現(xiàn)，其腸道水腫、出血(圖5)。無(wú)菌條件下取死亡大鼠的肝臟、肺臟、脾臟、心臟和腸道接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，分離得到病菌，用細(xì)菌16 S rRNA PCR鑒定為中間克呂沃菌。

3 討論

隨著國(guó)家對(duì)特種養(yǎng)殖業(yè)的扶持，眼鏡蛇養(yǎng)殖業(yè)

得到迅速發(fā)展，在養(yǎng)殖過(guò)程中，疾病尤其是細(xì)菌性疾病是制約養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素之一。與其他人獸共患病的病原微生物相比，關(guān)于蛇類細(xì)菌性病原的研究較少，因此養(yǎng)殖場(chǎng)一旦暴發(fā)疾病，很容易造成蛇類大量死亡，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失。韋平等[12]從患腐皮病的蛇中分離到變形桿菌、金黃色葡萄球菌以及銅綠假單胞菌等；王德青等[13]從患口腔炎的尖吻蝮中分離到金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌；梁月梅等[14]從蛇中分離到奇異變形桿菌；蘇接瑜等[15]從眼鏡蛇中分離到緩慢葡萄球菌等。

目前，關(guān)于克呂沃菌感染的病例較少，已報(bào)告的感染病例主要以人為主。本試驗(yàn)從患病眼鏡蛇中分離出中間克呂沃菌，致病力試驗(yàn)表明，該菌是導(dǎo)致眼鏡蛇死亡的致病菌，這是首次從眼鏡蛇中分離出中間克呂沃菌，豐富了蛇類病原菌樣本庫(kù)。

蛇病的防治是蛇類養(yǎng)殖的重要環(huán)節(jié)，其關(guān)鍵在于檢測(cè)與用藥。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，克呂沃菌分離株對(duì)阿米卡星、慶大霉素、亞胺培南、美洛培南等抗菌藥物高度敏感，對(duì)氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、復(fù)方新諾明、氯霉素、四環(huán)素、哌拉西林耐藥。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，可選用阿米卡星、慶大霉素等藥物進(jìn)行治療。同時(shí)，養(yǎng)殖戶在用藥時(shí)要注意不要長(zhǎng)期使用同一種藥物，以免產(chǎn)生耐藥性。

表2 病原菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

Table 2 Antimicrobial sensitivity of pathogenic bacteria

藥敏片名稱Antimicrobialname藥物含量/μgDrugcontent結(jié)果Result阿米卡星 Amikacin30S慶大霉素 Gentamicin10S亞胺培南 Imipenem10S美洛培南 Meropenem10S頭孢唑林 Cefazolin30I頭孢他啶 Ceftazidime30S頭孢噻肟 Cefotaxime30S頭孢吡肟 Cefepime30S氨曲南 Aztreonam30S氨芐西林 Ampicillin10R阿莫西林/克拉維酸Amoxicillin/Clavulanate20/10S氨芐西林/舒巴坦Ampicillin/Sulbactam10/10R哌拉西林/他唑巴坦Piperacillin/Tazobactam100/10S復(fù)方新諾明Trimethoprim/Sulfamethoxazole1.25/23.75R氯霉素 Chloramphenicol30R環(huán)丙沙星 Ciprofloxacin5I左氧沙星 Levofloxacin5S四環(huán)素 Tetracycline30R哌拉西林 Piperacillin100R

注：R.耐藥；I.中度敏感；S.高度敏感。

Note：R.Resistance;I.Intermediate;S.Sensitive.

圖5 SD大鼠剖檢病理變化

值得注意的是，在之前的報(bào)道中，克呂沃菌只感染人，本試驗(yàn)從眼鏡蛇中分離出克呂沃菌，表明克呂

沃菌極可能是一種人畜共患病的致病菌。因此，加強(qiáng)眼鏡蛇養(yǎng)殖過(guò)程中的疾病防治和管理，不僅有利于養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，還具有重要的公共衛(wèi)生意義。

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Isolation,Identification and Antimicrobial Susceptibility Test ofKluyveraintermediain Cobra

DU Le-yan1,3,WANG Hai-feng3,SHI Xiao2,ZHAO Bao-hua1,HE Hong-xuan3

(1.HebeiNormalUniversity,Shijiazhuang,Hebei,050024,China;2.TheAquaticWildlifeRescueandConservationCenter,Beijing,102100,China;3.InstituteofZoology,ChineseAcademyofSciences,Beijing,100101,China)

This study focused on the bacterial pathogen that infected snakes.Kluyveraintermediawas isolated from sick cobra of snake farm in Changping district,Beijing,through postmortem,histopathological examination,pathogen isolation,biochemical identification,16 S rRNA PCR,and pathogenicity test.The result of antimicrobial susceptibility test showed thatKluyveraintermediawas highly sensitive to amikacin,gentamicin,gentamicin,meropenem,meropenem,cefotaxime,cefepime,cefepime,amoxicillin/clavulanate,piperacillin/tazobactam and levofloxacin; but resistant to ampicillin,ampicillin,chloramphenicol,trimethoprim/sulfamethoxazole,tetracycline and piperacillin,which provided useful information for treatment of cobra infection withKluyveraintermedia.

cobra;Kluyveraintermedia;isolation and identification;antimicrobical susceptibility test

2016-03-16

杜樂(lè)妍(1990-)，女，河北石家莊人，碩士研究生，主要從事分子細(xì)菌學(xué)研究。*通訊作者

S858.9

A

1007-5038(2016)12-0073-05